JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Published: December 30, 2016
doi:
10.3791/55015
, , ,
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna,Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

Summary

פרוטוקול זה מתאר את דור phenotyping לשחזור של תאי T רגולטוריים מושרה אדם (iTregs) מתאי CD4 + T נאיביים במבחנה. פרוטוקולים שונים לזירוז FOXP3 לאפשר לחקר פנוטיפים iTreg הספציפיים שהושגו עם פרוטוקולי בהתאמה.

Abstract

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes.

Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human naïve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-β plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR.

These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained.

A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-β plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

Introduction

CD4 + CD25 + FOXP3 + תאי T רגולטוריים (Tregs) לדכא תאי חיסון אחרים והם מתווכים קריטיים של סובלנות היקפית, אוטואימוניות במניעת 1 דלקת מופרזת. חשיבותה של Tregs מודגמת על ידי enteropathy האדם המחלה immunodysregulation polyendocrinopathy תסמונת ה- X-צמודות (אייפקס), שבו אובדן Tregs עקב מוטציות בשנות ה P3 תיבת forkhead גורם שעתוק Treg master' (FOXP3) מוביל למחלות אוטואימוניות מערכתי חמור, קטלן בגיל צעיר. עם זאת, Tregs לפעול כחרב פיפיות במערכת החיסונית: הם גם יכולים להפריע חסינות אנטי סרטנית במסגרות מסוימות 2. מניפולציה טיפולית של מספר ותפקוד Treg לפיכך כפופה חקירות קליניות רבות. בשנת סרטן, דלדול של Tregs יכול להיות רצוי והצלחה חלק גישות קליניות מעודדת מחקר נוסף 3. במחלות אוטואימוניות ודלקתיות, בנוסף השפעות טיפוליות של Tregs ב seveמודלי עכבר מחל RAL, ניסויים-האדם ראשונים האחרונים של העברת מאמצת Treg למנוע graft- מול מחל -host (GvHD) 4 – 7 ועל מנת להעריך את בטיחות בטיפול בסוכרת סוג 1 8 הראו תוצאות מבטיחות מאוד.

בטבע הופעת Tregs (nTregs) מהווה tTregs נגזרות הרתי ואת שולה מושרה pTregs, עם פונקציות חיוניות לא יתירים בשמירה על בריאות 9 – 11. עם זאת, מספרי nTreg מוגבלים, עידוד הגישה המשלימה של Tregs התרמה (iTregs) במבחנה מן מבשרי תא T נאיביים 12. עדיין יציבות iTregs, ככל הנראה בשל חוסר demethylation באזור demethylated שנקרא Treg הספציפי (TSDR) ב לוקוס גן FOXP3 13, נותרת חשש וכמה מחקרים מצביעים על כך in vivo מושרה Tregs יציבים יותר 14.

נכון להיום, FOXP3 נשאר מ 'החלבון הטוב ביותרarker עבור Tregs אבל זה לא ספציפי לחלוטין כי תאי CD4 + T CD25- קונבנציונאלי אדם זמני מבטאים רמות ביניים של FOXP3 באקטיבציה 15,16. למרות התקדמות משמעותית נעשתה הבהרת בקרת הביטוי FOXP3, הרבה נשאר להתגלות לגבי אינדוקציה, יציבות ותפקוד של FOXP3 במיוחד בתאים אנושיים. למרות ההבדלים כדי nTregs, במבחנה המושרה FOXP3 + CD4 + T תאים יכול לשמש כמערכת מודל ללמוד המנגנונים המולקולריים של אינדוקציה FOXP3 ו כנקודת המוצא לפיתוח פרוטוקולים בעתיד המאפשרים דור iTregs כי הם דומים יותר ב vivo שנוצר Tregs, אשר יכול להיות רלוונטי עבור אסטרטגיות העברת מאמצת בעתיד.

יש `אין פרוטוקול הזהב standard' לגרום iTregs אדם, ופרוטוקולים נוכחיים פותחו בהתבסס על מחק תנאי Treg וישכנע in vivo: אינטרלוקין 2 (IL-2) והאיתות גורם הגדילה הפיכת β (TGF-β) הם קריטיים לזירוז FOXP3 in vivo 17, וכל-טרנס החומצה הרטינואית (ATRA) – אשר מופק in vivo על ידי תאים דנדריטים הקשורים במעיים – משמש לעתים קרובות כדי לשפר אינדוקציה FOXP3 במבחנה 18 – 21. פתחנו פרוטוקולי Treg וישכנעו אדם נוספים באמצעות בוטיראט 22, בטן חיידקים נגזרת חומצת שומן קצרה שרשרת אשר הוצגה לאחרונה להגדיל בעכברי Treg אינדוקציה 23,24. אנחנו גם קימה לאחרונה פרוטוקול חדש עבור דור של iTregs עם פונקציה מדכאת מעולה במבחנה באמצעות שילוב של TGF-β, ATRA ו Rapamycin 22, האחרון הוא יעד יונק אשר קליני של rapamycin (mTOR) מעכב כי ידוע כדי לקדם תחזוקת FOXP3 במהלך התרחבות אדם Treg 25,26.

שיטה זו מתארת את לשחזורדור במבחנה של CD4 אדם + FOXP3 + iTregs באמצעות סדרה של תנאים שונים, phenotyping הבא שלהם על ידי cytometry זרימת תגובת שרשרת פולימראז השעתוק כמוני הפוך (qRT-PCR) לחשוף את דפוסי פרוטוקול ספציפי ביטוי של FOXP3 ומולקולות חתימת Treg אחרים כגון כמו CD25, CTLA-4, EOS, כמו גם הדיכוי של-γ IFN ו- SATB1 הביטוי 22. אוכלוסיות התאים שנוצרו יכולות לשמש מבחנים תפקודיים לגבי פעילות מדכאת או עבור מחקרים מולקולריים, בין אם בנוגע רגולטורי FOXP3 כלליים או ללמוד השפעות ספציפיות תרכובות מסוימות כגון בוטיראט או rapamycin. הבנה נוספת של מנגנונים מולקולריים נהיגת בידול Treg רלוונטית ביותר עבור גישות טיפוליות עתידיות אוטואימוניות או סרטן למקד מולקולות מעורבות במיוחד בדור Treg ותפקוד.

Protocol

תאי דם היקפיים mononuclear האדם (PBMCs) היו מבודדים טרי מ מעילים באפי מתורם בריא ואנונימי שנקנו החולים האוניברסיטאי קרולינסקה שבשבדיה. היתר אתי עבור הניסויים התקבל המועצה לביקורת האתית האזורית בשטוקהולם (Regionala etikprövningsnämnden אני שטוקהולם), שוודיה (מספר אישור: 2013 / 1458-1431 / 1). <p class="jove_title" style…

Representative Results

איור 1 מציג סכמה של הגדרת הניסוי. איור 2 מראה מכתים מלא טוהר נציג תאי nTregs CD4 + T מבודדים מגנטי נאיביים. F igure 3A מראה את זרימת cytometry האסטרטגיה gating ואיור 3 ב מצ…

Discussion

הפרוטוקול המתואר מאפשר האינדוקציה החזקה של CD4 + אדם FOXP3 + iTregs מתאי אדם נאיביים CD4 + T. היא כוללת פרוטוקול חדשות שתארנו לאחרונה, באמצעות שילוב של TGF-β, ATRA ו rapamycin, לזירוז של iTregs עם פונקציה מדכאת מעולה במבחנת 22. לעומת פרוטוקולים שפורסמו אחרים, יתרון נוסף הוא ה?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nina Nagel is gratefully acknowledged for technical assistance during the video shoot and experimental preparation. We thank Eva-Maria Weiss for help with the intracellular FOXP3 staining protocol and Elisabeth Suri-Payer and Nina Oberle for establishing the nTreg isolation protocol. Matilda Eriksson and Peri Noori are acknowledged for laboratory management.

Funding: A.S. was supported by a Marie Curie Intra European Fellowship within the 7th European Community Framework Programme, the Dr. Åke Olsson Foundation and KI research foundations; A.S. and J.T. were supported by a CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease) grant, J.T. was supported by Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance and Stockholm County Council.

Materials

All-trans retinoic acid Sigma Aldrich R2625-50MG  
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 eBioscience 17-4777-42
anti-human CD25 microbeads Miltenyi Biotec 130-092-983
anti-human CD25-PE Miltenyi Biotec 130-091-024
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified  Biolegend 302914
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified  Biolegend 317315
anti-human CD45RA , FITC Miltenyi Biotec 130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 BD Biosciences 555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 BD Biosciences 345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a eBioscience 48-0086-42 
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 BD Biosciences 562743
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k eBioscience 11-7319-81 
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug BD Biosciences 555029
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11754-250
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque GE healthcare 17-1440-03
DMSO 99,7% Sigma Aldrich D2650-5X5ML
FBS, heat inactivated Invitrogen 10082-147
Fixable Viability Dye, eFluor 780   eBioscience 65-0865-14 or 65-0865-18 
Foxp3 Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00  Caution, contains Paraformaldehyde
Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set 
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Invitrogen 35050-061
human naive CD4 T cell isolation kit II Miltenyi Biotec 130-094-131
nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT
human naive CD4 T cell isolation kit II
nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT,nojavascript&WT
Miltenyi Biotec
130-094-131
Human serum albumin 50 g/l Baxter 1501057
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% Sigma Aldrich I9657-1MG
MACS LS-columns Miltenyi Biotec 130-042-401
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1  eBioscience 17-4714-42 
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 ug  eBioscience 11-4714-81 
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 BD Biosciences 563464
Pasteur pipet plastic, individually packed Sarstedt 86.1172.001  
PMA PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE Sigma Aldrich P1585-1MG 
Rapamycin EMD (Merck) 553210-100UG
Recombinant Human IL-2, CF R&D 202-IL-050/CF
Recombinant Human TGF-beta 1, CF RnD 240-B-010/CF
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit Ambion AM1931  
RPMI 1640 Medium  Invitrogen 72400-054 
Sodium butyrate Sigma Aldrich B5887-250MG 
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred Lonza 04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage)  Applied Biosystems 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 Caution, contains Paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) Applied Biosystems 4351370; assay ID: Hs04194366_g1   Caution, contains Paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Master mix Applied Biosystems 4369514
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189 (2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152 (2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -. M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474 (2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41 (2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90 (2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Tags

In VitroDifferentiationHumanCD4+FOXP3+Induced Regulatory T CellsITregsNaive CD4+ T CellsTGF-βPhenotypeT Cell ImmunologyPBMCMagnetic Bead IsolationBiotin AntibodyAnti-biotin MicrobeadsLS Column

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schmidt, A., Éliás, S., Joshi, R. N., Tegnér, J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naïve CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol. J. Vis. Exp. (118), e55015, doi:10.3791/55015 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image