In vitro differentiatie van humane CD4 ⁺ FOXP3 ⁺ geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 ⁺ T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol

CD4 + CD25 + FOXP3 + regulerende T-cellen (Tregs) onderdrukken andere immuuncellen en zijn kritische mediatoren van perifere tolerantie voorkomen autoimmuniteit en overmatige ontsteking ^1. Het belang van Tregs wordt geïllustreerd door de menselijke ziekte immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathie X-gebonden syndroom (IPEX), waarbij verlies van Tregs door mutaties in het `master' Treg transcriptiefactor forkhead box P3 (FOXP3) leidt tot ernstige systemische auto-immuunziekte, dodelijke op jonge leeftijd. Echter, Tregs fungeren als een tweesnijdend zwaard in het immuunsysteem als ze ook kunnen belemmeren anti-tumor immuniteit in bepaalde instellingen ^2. Therapeutische manipulatie van Treg aantal en de functie is dan ook om tal van klinisch onderzoek onderworpen. Bij kanker kunnen depletie van Tregs gewenst zijn en enig succes van klinische benaderingen bevordert verder onderzoek ^3. In auto-immuun- en ontstekingsziekten, in aanvulling op therapeutische werking van Tregs in several muis ziektemodellen, recent als eerste in-man proeven van adoptieve Treg overdracht te voorkomen graft versus -host ziekte (GvHD) ^4-7 en de veiligheid in de behandeling van type 1 diabetes ⁸ beoordelen toonde veelbelovende resultaten.

Natuurlijk voorkomende Tregs (nTregs) omvatten-thymus afgeleide tTregs en perifeer veroorzaakte pTregs, met niet-redundante essentiële functies voor het behoud van de gezondheid van ^9-11. Echter, nTreg aantallen zijn beperkt, het stimuleren van de complementaire aanpak van het induceren van Tregs (iTregs) in vitro van naïeve T-cel voorlopers ^12. Still stabiliteit van iTregs, waarschijnlijk door een gebrek aan demethylering in de zogenoemde Treg-gedemethyleerde specifieke regio (TSDR) in FOXP3 gen locus ^13, een punt van zorg en verschillende studies geven aan dat in vivo geïnduceerde Tregs stabieler ^14.

Tot op heden, FOXP3 blijft de beste eiwit mArker voor Tregs, maar het is niet absoluut specifiek omdat conventionele menselijke CD4 + CD25 T-cellen die tijdelijk gemiddeld niveau van expressie FOXP3 bij activering ^15,16. Hoewel aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het ophelderen van de regulering van FOXP3 meningsuiting, nog veel te ontdekken met betrekking tot de inductie, de stabiliteit en de functie van FOXP3 name in menselijke cellen. Ondanks verschillen nTregs in vitro geïnduceerde FOXP3 + CD4 ⁺ T-cellen kunnen worden gebruikt als een modelsysteem voor de moleculaire mechanismen van FOXP3 inductie bestuderen en als uitgangspunt voor protocollen in de toekomst die het mogelijk maken voor het genereren van iTregs die meer lijken op in zijn ontwikkeling vivo gegenereerd Tregs, die van toepassing zijn voor adoptieve overdracht strategieën in de toekomst zou kunnen zijn.

Noch `goud standard' protocol menselijke iTregs induceren en huidige protocollen werden ontwikkeld volgens nabootsen Treg-inducerende omstandigheden in vivo: interleukine 2 (IL-2) En transformerende groeifactor β (TGF-β) signalering cruciaal voor FOXP3 inductie in vivo ^17, en all-trans retinoïnezuur (ATRA) – die in vivo wordt geproduceerd door de darm geassocieerde dendritische cellen – wordt vaak gebruikt om FOXP3 inductie verbeteren in vitro ^18-21. We hebben extra personeel Treg-inducerende protocollen gebruikt butyraat ^22, een darmflora afkomstige korte keten vetzuur dat recentelijk werd aangetoond dat murine Treg inductie ^23,24 vergroten ontwikkeld. We hebben ook onlangs een nieuw protocol voor het genereren van iTregs met superieure onderdrukkende functie in vitro met behulp van een combinatie van TGF-β, ATRA en rapamycine ^22, waarbij de laatste een klinisch goedgekeurd zoogdieren doelwit van rapamycin (mTOR-remmer) waarvan bekend is dat te bevorderen FOXP3 onderhoud tijdens de menselijke Treg expansie ^25,26.

Deze methode beschrijft de reproduceerbaarvitro genereren van humane CD4 + FOXP3 + iTregs met een aantal verschillende omstandigheden, en de latere fenotypering van flowcytometrie en kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) protocol-specifieke expressiepatronen van FOXP3 en andere Treg handtekening moleculen openbaren zoals CD25, CTLA-4, EOS, en onderdrukking van IFN-γ en SATB1 expressie ^22. De gegenereerde celpopulaties kan worden gebruikt voor functionele bepalingen inzake onderdrukkende activiteit of voor moleculaire studies, ofwel betreffende algemene FOXP3 regulators of effecten specifiek voor bepaalde verbindingen zoals butyraat of rapamycine bestuderen. Verder inzicht in de moleculaire mechanismen die Treg differentiatie is zeer relevant voor toekomstige therapeutische benaderingen in auto-immuniteit of kanker om specifiek te richten moleculen betrokken bij Treg generatie en functie.