التمايز في المختبر من خلايا CD4 الإنسان + FOXP3 + المستحثة تنظيم الخلايا التائية (iTregs) من خلايا CD4 + T السذاجة باستخدام بروتوكول تحتوي على TGF-β-
Summary
يصف هذا البروتوكول الجيل استنساخه وphenotyping من صنع الإنسان خلايا T التنظيمية (iTregs) من خلايا CD4 + T ساذجة في المختبر. بروتوكولات مختلفة لتحريض FOXP3 تسمح لدراسة الظواهر iTreg محددة تم الحصول عليها مع البروتوكولات ذات الصلة.
Abstract
Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes.
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human naïve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-β plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR.
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained.
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-β plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.
Introduction
CD4 + CD25 + FOXP3 + الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) قمع الخلايا المناعية الأخرى، وهي سطاء الحرجة من التسامح الطرفية، ومنع المناعة الذاتية والمفرط التهاب 1. ومن الأمثلة على أهمية Tregs من الأمراض التي تصيب البشر العاشر مرتبطة immunodysregulation polyendocrinopathy الأمعاء متلازمة (IPEX)، الذي فقدان Tregs بسبب طفرات في `master' Treg عامل النسخ مربع forkhead P3 (FOXP3) يؤدي إلى أمراض المناعة الذاتية النظامية شديد، قاتلة في سن مبكرة. ومع ذلك، Tregs بمثابة سيف ذو حدين في الجهاز المناعي لأنها يمكن أن تعرقل أيضا الحصانة المضادة للورم في بعض الإعدادات 2. التلاعب العلاجي لعدد Treg وظيفة وبالتالي خاضعة للعديد من التحقيقات السريرية. في السرطان، يمكن أن استنزاف Tregs يكون من المرغوب فيه وبعض نجاح النهج السريرية يشجع المزيد من البحوث 3. في أمراض المناعة الذاتية والالتهابات، بالإضافة إلى الآثار العلاجية من Tregs في سفنماذج المرض الماوس راؤول، مؤخرا أول التجارب في الرجل نقل Treg بالتبني لمنع graft- مقابل -host المرض (GvHD) 4-7، وتقييم السلامة في علاج مرض السكري نوع 1 8 أظهر نتائج واعدة جدا.
طبيعيا Tregs (nTregs) تشمل tTregs المستمدة التوتة وpTregs الناجم عن محيطي، مع وظائف أساسية غير زائدة عن الحاجة في الحفاظ على صحة 9-11. ومع ذلك، أرقام nTreg محدودة، وتشجيع نهج متكامل من حمل Tregs (iTregs) في المختبر من السذاجة السلائف الخلايا التائية 12. لا يزال استقرار iTregs، ويفترض نظرا لعدم وجود نزع الميثيل في ما يسمى منطقة demethylated Treg محددة (TSDR) في موضع FOXP3 الجين 13، لا يزال مصدر قلق وتشير العديد من الدراسات أن في الجسم الحي الناجم Tregs هي أكثر استقرارا 14.
حتى الآن، لا تزال FOXP3 أفضل بروتين مarker لTregs لكنها ليست محددة تماما لأن خلايا CD4 + T CD25- التقليدية الإنسان التعبير عن عابر المستويات المتوسطة من FOXP3 على تفعيل 15،16. على الرغم من إحراز تقدم كبير في توضيح تنظيم التعبير FOXP3، لا يزال هناك الكثير ليتم اكتشافه بخصوص تحريض والاستقرار وظيفة FOXP3 خاصة في الخلايا البشرية. وعلى الرغم من الاختلافات إلى nTregs، في المختبر يسببها FOXP3 + خلايا CD4 + T يمكن استخدامها كنظام نموذج لدراسة الآليات الجزيئية للتحريض FOXP3 وكنقطة انطلاق لوضع بروتوكولات في المستقبل التي تسمح لجيل من iTregs التي هي أكثر شبها في فيفو ولدت Tregs، التي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق لاستراتيجيات نقل بالتبني في المستقبل.
ليس هناك `بروتوكول الذهب standard' للحث على iTregs البشري، وتم البروتوكولات الحالية مبنية على محاكاة الظروف Treg الذي يحفز في الجسم الحي: انترلوكين 2 (IL-2) وتحويل β عامل النمو (TGF-β) إشارات حاسمة لتحريض FOXP3 في الجسم الحي 17، وجميع العابر حمض الريتينويك (atra) – كثيرا ما يستخدم لتعزيز FOXP3 الاستقراء – الذي يتم انتاجه في الجسم الحي بواسطة الخلايا الجذعية المرتبطة الأمعاء في المختبر 18-21. لقد قمنا بتطوير بروتوكولات بشرية إضافية Treg الذي يحفز استخدام الزبدات 22 عاما، وهو مشتق الجراثيم-الأمعاء القصيرة سلسلة الأحماض الدهنية التي تم عرضها مؤخرا لزيادة الفئران Treg تحريض 23،24. نحن أيضا أنشأت مؤخرا بروتوكول جديد لجيل من iTregs مع وظيفة القمعية متفوقة في المختبر باستخدام مزيج من TGF-β، ATRA وrapamycin 22، وهذا الأخير هو الهدف الثدييات وافق سريريا من rapamycin (mTOR س) المانع أن يعرف لتعزيز صيانة FOXP3 أثناء البشرية Treg التوسع 25،26.
يصف هذا الأسلوب استنساخه فيجيل المختبر من خلايا CD4 الإنسان + FOXP3 + iTregs باستخدام مجموعة من الظروف المختلفة، وphenotyping في وقت لاحق من قبل التدفق الخلوي والكمي رد فعل عكسي سلسلة النسخ البلمرة (QRT-PCR) للكشف عن أنماط بروتوكول معين من التعبير عن FOXP3 وغيرها من Treg توقيع جزيئات هذه كما CD25، CTLA-4، EOS، وكذلك قمع الإنترفيرون γ وSATB1 التعبير 22. السكان الخلايا المتولدة يمكن استخدامها لالمقايسات الفنية بشأن النشاط القمعية أو الدراسات الجزيئية، سواء ما يتعلق المنظمين FOXP3 العامة أو لدراسة آثار محددة لبعض المركبات مثل الزبدات أو rapamycin. للمزيد من فهم الآليات الجزيئية القيادة Treg التمايز هو ذات أهمية كبيرة للنهج علاجية مستقبلية في المناعة الذاتية أو سرطان خصيصا لاستهداف جزيئات تشارك في توليد Treg وظيفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتيح بروتوكول صفها تحريض قوي من CD4 + البشري FOXP3 + iTregs من خلايا CD4 + T ساذجة الإنسان. ويتضمن البروتوكول الجديد الذي وصفنا في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام مزيج من TGF-β، ATRA وrapamycin، لتحريض iTregs مع متفوقة في المختبر القمعية وظيفة 22. مقارنة البروتوكولات الأخرى ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nina Nagel is gratefully acknowledged for technical assistance during the video shoot and experimental preparation. We thank Eva-Maria Weiss for help with the intracellular FOXP3 staining protocol and Elisabeth Suri-Payer and Nina Oberle for establishing the nTreg isolation protocol. Matilda Eriksson and Peri Noori are acknowledged for laboratory management.
Funding: A.S. was supported by a Marie Curie Intra European Fellowship within the 7th European Community Framework Programme, the Dr. Åke Olsson Foundation and KI research foundations; A.S. and J.T. were supported by a CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease) grant, J.T. was supported by Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance and Stockholm County Council.
Materials
| All-trans retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |||
| anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |||
| anti-human CD25 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |||
| anti-human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |||
| anti-human CD28 antibody, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |||
| anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |||
| anti-human CD45RA , FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |||
| anti-human CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |||
| anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |||
| anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |||
| anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 | BD Biosciences | 562743 | |||
| anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |||
| Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |||
| cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754-250 | |||
| Density centrifugation medium: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |||
| DMSO 99,7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |||
| FBS, heat inactivated | Invitrogen | 10082-147 | |||
| Fixable Viability Dye, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 or 65-0865-18 | |||
| Foxp3 Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Caution, contains Paraformaldehyde Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set |
||
| GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Invitrogen | 35050-061 | |||
| human naive CD4 T cell isolation kit II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |||
|
|
130-094-131 | |||
| Human serum albumin 50 g/l | Baxter | 1501057 | |||
| Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |||
| MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |||
| mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |||
| mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 ug | eBioscience | 11-4714-81 | |||
| mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |||
| Pasteur pipet plastic, individually packed | Sarstedt | 86.1172.001 | |||
| PMA PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |||
| Rapamycin | EMD (Merck) | 553210-100UG | |||
| Recombinant Human IL-2, CF | R&D | 202-IL-050/CF | |||
| Recombinant Human TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |||
| RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |||
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 72400-054 | |||
| Sodium butyrate | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |||
| T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred | Lonza | 04-418Q | |||
| TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
| TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4351370; assay ID: Hs04194366_g1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
| TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |
References
- Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
- DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
- Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
- Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
- Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189 (2015).
- Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
- Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
- Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
- Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
- Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
- Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152 (2013).
- Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
- Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
- Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
- Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
- Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
- Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -. M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474 (2016).
- Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
- Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
- Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41 (2011).
- Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90 (2011).
- Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
- Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
- Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
- Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
- Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
- Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
- Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
- Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
- McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
- Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
- Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
- Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
- Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).
