CyVerseリソースの活用<em>デ・ノヴォ</em>保存されていない（非モデル）生物の比較トランスクリプトーム

注記：手順1.2（ 図1および図2 ）で作成および命名されるフォルダに従って、全体のプロトコルに番号が付けられています。このプロトコルは、標準的な比較トランスコード解析の比較を表しており、ここで詳述されているすべてのステップは、すべての研究者にとって必要というわけではありません。このワークフローは、コンパニオンチュートリアルのwikiで完全に文書化されています。さらに、すべての追加ファイルと、各分析パッケージの第三者開発者のドキュメントへのリンクも含まれています（ 表1 ）。この資料へのリンクは、この情報に簡単にアクセスできるように、このプロトコル全体に含まれます。ベストプラクティスとは、タスクを達成するための最良の方法やユーザーが検討するための提案としてユーザーに提供されるメモであり、プロトコルのメモを介して伝達されます。例示的なデータ入力および分析出力のフォルダは、ユーザが公に利用可能であり、プロトコル（ de novo </em>トランスクリプトームアセンブリおよび分析。 1. FastQCを使用して、プロジェクトの設定、未加工シーケンシングリードのアップロード、アセスメントリードのアップロード AtmosphereとDiscovery Environmentへのアクセスを取得します。 登録ページ（ 例： person@institution.edu）に移動して、無料のCyVerseアカウントをリクエストしてください。 必要な情報を入力して提出してください。 メインのWebページ（http://www.cyverse.org/）に移動し、上部のツールバーで[サインイン]を選択します。 [Cyverseログイン]を選択し、Cyber​​Sightの資格情報を使用してサインインします。 [Apps＆サービス]タブに移動し、大気圏へのアクセスをリクエストします。ディスカバリー環境へのアクセスは自動的に許可されます。 プロジェクトを設定し、データをデータストアに移動します。 発見環境（https://de.iplantcollaborative.org/de）にログインします。 [データ]タブを選択すると、データストア内のすべてのフォルダを含むメニューが表示されます。 </> プロジェクトに関連するすべてのデータを格納するメインのプロジェクトフォルダを作成します。データウィンドウの上部にあるツールバーを見つけ、ファイル|新しいフォルダ。 "！@＃（）[] {}：; $％^＆*"などのフォルダ名や入出力ファイル名には、スペースや特殊文字を使用しないでください。代わりに、必要に応じてアンダースコアまたはダッシュ（_または – ）を使用します。 メインプロジェクトフォルダ内に5つのフォルダを作成して分析を整理します（ 図1 ）。フォルダには、「1_Raw_Sequence」、「2_High_Quality_Sequence」、「3_Assembly」、「4_Differential_Expression」、「5_Annotated_Assembly」のようにカンマまたは引用符を付けずにフォルダ名を付けます。サブフォルダは、これらのメインプロジェクトフォルダに配置されます（ 図2 ）。 図1：プロジェクトフォルダ構成とDe Novo Transcriptomeアセンブリおよび分析ワークフローの概要。ユーザーは生のシーケンシングの読み込みをデータストアのメインプロジェクトフォルダにアップロードし、各ステップの結果を別々のフォルダに配置します。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 図2 CyVerse Cyber​​infrastructureで発生するDe Novo Transcriptomeアセンブリおよび分析ワークフローの詳細。全体のアセンブリと分析のワークフローは、それぞれ独自のフォルダ（太字の番号付きフォルダアイコン）を取得する5つの手順で完了します。番号が付けられた5つのワークフローステップフォルダのそれぞれには、バイオインフォマティクス分析の出力データを含むサブフォルダがあります（フォルダアイコン）。解析用の入力は1つのサブフォルダから来て、分析プログラム（四角形ボックス）の出力を介して別のフォルダに移動します。最初の3つのステップからの最終データを比較し、出版の準備をします。結局のところ、このスキームは、共同作業者および/または原稿の査読者がワークフローを迅速に理解し、必要に応じて各ファイルを使用してそれを繰り返すことができるように、段階的に分析するメインプロジェクトフォルダを生成する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 次の3つの方法のいずれかを使用して、 "A_Raw_Reads"という名前のサブフォルダに "1_Raw_Sequence"フォルダに生FASTQシーケンスファイルをアップロードします。 データストアのシンプルアップロード機能を使用して、メインのDEデスクトップのデータボタンをクリックして[データ]ウィンドウのツールバーに移動し、[アップロード|アップロード]を選択します。デスクトップからの簡単なアップロード。 [参照]ボタンを選択します。ローカルコンピュータ上の生のFASTQシーケンシングファイルにナビゲートします。この方法は、2GB未満のファイルにのみ適しています。 アップロードを送信するには、画面の下部にある[アップロード]ボタンを選択します。通知はアップロードが提出されたベルアイコンのDEの右上に登録されます。アップロードが完了すると、別の通知が登録されます。 あるいは、Cyber​​duckを使って大きなファイル（https://wiki.cyverse.org/wiki/x/pYcVAQ）を転送してください。 Cyber​​duckをインストールし、ローカルコンピュータのデスクトップでプログラムとして実行します。 最後に、iCommandをダウンロードし、指示に従ってローカルコンピュータにインストールします（https://wiki.cyverse.org/wiki/display/DS/Using+iCommands）。 DEのFastQCアプリを使用して、アップロードされた生のシーケンシングの読み込みを評価します。 メインのDEデスクトップの「Apps」ボタンを選択すると、DEで利用可能なすべての分析アプリを含むウィンドウが開きます。 検索して勝利を開くウィンドウの上部にある検索ツールバーのFastQCツールのダウ複数のFASTQファイルがある場合は、マルチファイルバージョンを開きます。ファイル|新しいフォルダ "B_FastQC_Raw_Reads"という名前のフォルダを作成し、このフォルダを出力フォルダとして選択します。 FASTQの読み込みファイルを「Select input data」というツールウィンドウにロードし、「Launch Analysis」を選択します。 分析が完了したら、.htmlまたは.pdfファイルを開いて結果を表示します。 FastQCは、読み込みファイルのさまざまな側面をテストするいくつかの分析を実行します（ 図3 ）。 2.高品質シーケンスを生成するためのトリミングと品質フィルタリングRawリード注意：TrimmomaticアプリまたはSickleアプリを使用してください。 DEでプログラム可能なTrimmomaticアプリを検索し、以前と同じように開きます。 生のFASTQ読み込みファイルのフォルダを「設定」セクションにアップロードします。 選択するかどうかquenceファイルはシングルエンドまたはペアエンドです。 Browseボタンを選択し、/ iplant / home / shared / Trinity_transdecoder_trinotate_databasesを "Viewing："ボッ​​クスに貼り付けることで提供される標準コントロールファイルを使用します。 Trimmomaticv0.33_control_fileという名前のファイルを選択し、分析を開始します。このファイルをダウンロードして設定を編集し、2番目のプロジェクトフォルダにアップロードしてカスタムトリミングスクリプトを作成することができます。 オプション：FastQC解析でアダプター配列が特定された場合は、イルミナクリップ設定を使用してイルミナアダプターをトリミングします。上記のように、/ iplant / home / shared / Trinity_transdecoder_trinotate_databasesフォルダ内の適切なアダプタファイルを選択します。 Sickleを使用して品質トリミングシーケンスを読み取ります。 DEのSickleアプリを検索して開きます。トリミングされたFASTQの読み込みを入力読み込みとして選択し、出力ファイルの名前を変更します。オプションに品質設定を含めます。典型的な設定は、品質フォーマットです：illumina、sanger、solexa;品質t閾値：20;最小長さ：50 すべての出力をトリムされフィルタリングされたフォルダに移動します（2_High_Quality_Sequence）。 FastQCを使用して最終読み取りを評価し、以前のFastQCレポートと比較します。 .htmlファイルを選択すると、すべての結果のWebページが表示されます。表示できない場合は、出力で提供されているイメージファイル（.png）のフォルダを選択します。 De Novoトランスクリプトームアセンブリ大気中でトリニティを使用する wikiページ（https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ）に移動して、Atmosphereインスタンスの最新バージョンを開きます。トリニティとトリノテート画像の最新バージョンのリンクを選択します。あるいは、Atmosphere画像検索ツール（https://atmo.iplantcollaborative.org/application/images）の「Trinotate」を検索して、TrinityおよびTrinotate画像のすべてのバージョンを表示することもできます。 「ログインする」ボタンを選択して、大気i状態。 「medium3」（CPU：4、Mem：32GB）または「large3」（CPU：8、Mem：64GB）のインスタンスサイズを選択します。インスタンスを起動し、インスタンスが構築されるのを待ちます。まれに、CyVerseはプラットフォームを更新するためにメンテナンスを受けます。既存のインスタンスはこれらの更新中に使用できますが、新しいインスタンスを作成することはできません。 CyVerse Statusページにアクセスして、どのプラットフォーム（http://status.cyverse.org/）の現在の状態を確認します。 準備が整ったらインスタンスを開くには、名前をクリックし、右側のメニューの下部にある「リモートデスクトップ」を選択します。メッセージが表示されたら、JavaとVNC Viewerを許可します。 VNCビューアウィンドウで「接続」ボタンを選択し、「続行」を選択します。 ログインして、新しいクラウドコンピューティングのインスタンスとなる別のウィンドウを開きます。 手順1.3.1〜1.3.4で説明されている3つの方法のいずれかを使用して、トリミングまたはフィルタ処理されたFASTQ読み取りファイルをインスタンスに移動します。米国eインターネットブラウザがDEにアクセスし、以前と同じようにローカルコンピュータ上のファイルをダウンロードします。または、大きなデータセットを素早く転送するために、これらのイメージにインストールされたiCommandsを使用してください。 高品質の読み込みを組み立てるためにTrinityを実行する。 Atmosphereインスタンスに分析フォルダを設定します。 DE（/ iplant / home / shared / Trinity_transdecoder_trinotate_databases）のスクリプトを使用するか、wikiページ（https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ）のコマンドをコピー＆ペーストしてください。すべてのコマンドの説明はwikiページにあります。 解析フォルダとTrinotateデータベースが確立したら、上記のコマンドを使用してTrinityアセンブラを実行します。いくつかの出力ファイルがありますが、最も重要なものは「Trinity.fasta」というタイトルの最終アセンブリファイルです。データストア（フォルダ3_Assembly）に移動する前に、このFASTAファイルの名前を生物に特有の名前に変更し、混乱の可能性を最小限に抑えます。 注：アウトプットは、フォルダー（4_Differential_Expression）への異なる遺伝子発現解析のための数をカウントします。 rnaQUASTを使用してアセンブリを評価します（ 図4 ）。 トリニティ出力ファイルをDE内の "3_Assembly"フォルダに移動し、 "A_Trinity_de_novo_assembly"フォルダにラベルを付けます。 "A_Trinity_de_novo_assembly"フォルダ内のサブフォルダにアセンブルされた各トランスクリプトームには、トランスクリプトームに関連する生物や治療法の学名などの固有の名前を付けます。 "3_Assembly"フォルダに "B_rnaQUAST_Output"という別のサブフォルダを作成します。 「rnaQUAST 1.2.0（denovo based）」という名前のアプリを開き、分析に名前を付けて、出力フォルダとして「B_rnaQUAST_Output」を選択します。 デノボアセンブリFASTAファイルを「データ入力」セクションに追加します。 [データ出力]セクションに、 de novoの一意の名前を入力します</em>組み立て。これは、 "B_rnaQUAST_Output"フォルダ内のrnaQUAST出力ファイルのフォルダを作成します。 「GenemarkS-T Gene Prediction」、「BUSCO」、および「Parameters」セクションで追加のオプションを選択します。 生物が真核生物でない場合は、「GenemarkS-T Gene Prediction」セクションの原核生物を選択してください。 BUSCOを実行してブラウズボタンを選択し、iplant / home / shared / iplantcollaborative / example_data / BUSCO.sample.dataのパスを "Viewing："ボッ​​クスにコピーし、enterを押します。その生物に利用可能な最も特定のBUSCOフォルダを選択します。 注：BUSCOは、系統特異的コア遺伝子についてアセンブリを評価し、コア遺伝子の何％が見出されるかを出力する。真核生物のような一般的なフォルダと、節足動物などのより具体的な系統があります。 "Transcript decoder"を検索し、 de novで Transdecoderを実行するトリニティ・アセンブリは、ディスカバリー環境のFASTAファイルを出力します。 ステップ5 Annotationで使用するために、出力.pepファイルをde novo assembly（3_Assembly）フォルダに移動します。 DEにおけるDESeq2を用いた対の微分方程式前述のようにDE内のDESeq2アプリを開きます。分析に名前を付け、出力フォルダーを4_Differential_Expressionとして選択します。 [入力]セクションで、トリニティアセンブリの実行からのカウントテーブルファイルと、そのカウントテーブルでコンティグ名が見つかる列を選択します。 カウントデータテーブルファイルから列ヘッダーを入力して、比較する列を決定します。各条件の間にコンマを入れてください。コンティグ名を含む最初の列ヘッダーを含めないでください。 複製の場合、同じ名前を繰り返します（ 例えば 、Treatment1rep1、Treatment1rep2、Treatment1rep3はTreatment1、Treatment1、Treatment1になります）。第一に2番目の行には、比較する2つの条件の名前を指定します（ 例： Treatment1、Treatment2）。最初の行に指定されている列ヘッダー名と一致します。 注：これらの列ヘッダーは英数字で、特殊文字は使用できません。 5.トリノテートを用いたアノテーション AtmosphereクラウドコンピューティングのインスタンスでTrinotateの各部分を実行します。注意：bashコマンドは、txtファイルで提供され、DE（/iplant/home/shared/Trinity_transdecoder_trinotate_databases）またはwikiページ（https://wiki.cyverse.org/）で実行する前にコピー、貼り付け、変更することができます。 wiki / x / dgGtAQ）。複数のアセンブリに注釈を付ける場合は、各アセンブリに一度に注釈を付け、完成した注釈ファイルをアセンブリ名に対応する固有のフォルダを持つフォルダ「5_Annotation」に戻します。 Trinity転写物を検索するためのbashコマンドを実行します。 CPUの数に合わせてスレッド数を変更するすなわち、媒体には4つのCPUがあり、大には8つのCPUがあります。詳細はステップ3.1.2を参照してください。アセンブリFASTAファイル名と一致するようにTrinity.fastaコマンドを変更します。 注：BLAST +の検索には最も時間がかかります。完了するまでに数日かかることがあります。クラウドコンピュータのアクティビティは、VNCビューアを起動しなくても大気中で確認できます。 トランスコードを予測するタンパク質を検索するためのbashコマンドを実行します。これまでのように、スレッド番号とファイル名を5.2.1の条件に合わせて変更します。 HMMERのbashコマンドを実行し、上記のようにスレッド数を変更します。 必要に応じて、signalPおよびtmHMMのbashコマンドを実行します。 SignalPはシグナルペプチドを予測し、tmHMMは膜貫通タンパク質モチーフを予測する。 結果をSQLiteデータベースにロードする上記のすべての分析が完了したら、bashコマンドを実行して出力ファイルを最終的なSQLiteアノテーションデータベースにロードします。コマンドを削除する実行されなかった分析のために。 一般的なテーブルビューアで表示するには、SQLiteデータベースを.xlsファイルにエクスポートします。