La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo,<em> Dermestes maculatus</em

En 1998, Fire y Mello informaron de que el ARN de doble cadena (dsRNA) puede inducir la inhibición de la función de genes en Caenorhabditis elegans ^1. Esta respuesta desencadenada por dsRNA se denomina ARN de interferencia (RNAi), y se informó como el silenciamiento de genes mediada por ARNi ser conservadas en los animales, las plantas y los hongos ^2-7. En las plantas y algunos animales, las funciones de RNAi sistémica, lo que significa que el efecto se pueden propagar a otras células / tejidos en los que no se introduce directamente ARN de doble cadena (revisado en ^8-10). Los científicos han hecho uso de esta respuesta ARNi celular endógeno mediante el diseño de ARN de doble cadena para apuntar genes de interés, llamando así a la baja la función de genes sin manipular directamente el genoma (revisado en ^11-14).

RNAi es una herramienta poderosa para los estudios funcionales debido a las siguientes ventajas. En primer lugar, incluso con un mínimo de información de la secuencia de genes, un gen puede ser objetivo utilizando RNAi. Esto es especialmente importante para studies de organismos modelo que carecen de datos genómicos o transcriptómica. En segundo lugar, en los organismos donde la respuesta RNAi es robusta sistémica, mediada por RNAi desmontables gen se puede realizar en casi cualquier etapa de desarrollo. Esta característica es muy útil para estudiar la función de genes pleiotrópicos. En tercer lugar, en algunos casos, los efectos de RNAi se propagan a las gónadas y la progenie, como que los fenotipos se observan en la descendencia ^15,16. Este fenómeno, conocido como parental RNAi (pRNAi), es especialmente ventajoso para los genes que afectan el desarrollo embrionario, tan numerosos descendencia producida por un solo padre inyectado puede examinarse sin manipulación directa de los huevos. Por estas razones, pRNAi es el método de elección. Sin embargo, si pRNAi es ineficaz, por ejemplo, para los genes necesarios para la ovogénesis, entonces embrionario RNAi (eRNAi) debe ser utilizado. En cuarto lugar, RNAi puede ser utilizado para generar el equivalente de una serie alélica en que la cantidad de dsRNA entregado se puede variar en un rango para producir débil para defectos fuertes. una gradación de fenotipos Tal puede ser útil para la comprensión de la función del gen cuando el gen está implicado en un proceso complejo y / o la pérdida completa de la función es letal. En quinto lugar, la entrega de dsRNA es generalmente fácil y factible, especialmente en animales que muestran robustas respuestas RNAi sistémicos. ARN de doble cadena puede ser introducido mediante microinyección ^1,5, la alimentación / ingestión ^17,18, remojo, ^19,20 y virus / bacterias mediada por la entrega ^21,22. En sexto lugar, a diferencia de algunos métodos de focalización / edición de genes, no hay necesidad para la detección de organismos portadores de la mutación o para llevar a cabo los cruces genéticos para generar homocigotos utilizando RNAi. Por lo tanto, en comparación con muchas otras técnicas para estudiar la función de genes, RNAi es rápido, barato, y se puede aplicar para pantallas de gran escala ^23-25.

La amplia utilidad del ARNi proporciona medios para llevar a cabo estudios funcionales en una amplia gama de organismos, la ampliación de la gama de especies disponibles para el estudio Beyond los sistemas modelo tradicional para el que se han desarrollado herramientas genéticas. Por ejemplo, se requieren estudios que utilizan sistemas que no son modelos para dar una visión de la evolución de los genes y las redes de genes mediante la comparación de las funciones de los ortólogos de especies que representan diferentes modos de desarrollo o exhibir características morfológicas distintas ^26-29. Estos tipos de estudios proporcionarán una mejor comprensión de la diversidad biológica, con repercusiones tanto para la investigación básica y aplicada.

Siendo el grupo animal más grande del planeta, los insectos proporcionan una gran oportunidad para explorar los mecanismos de la diversidad subyacente. Además, los insectos son generalmente pequeños, tienen ciclos de vida cortos, alta fecundidad, y son fáciles de criar en el laboratorio. En las últimas dos décadas, el ARNi se ha aplicado con éxito en los insectos que abarca órdenes, incluyendo dípteros (moscas verdaderas) ^5, Lepidoptera (mariposas y polillas) ^30, coleópteros (escarabajos) ^16,31, himenópteros (Sawfmentiras, avispas, hormigas y abejas) ^32, hemípteros (chinches), Isoptera (termitas) ^34, Blattodea (cucarachas) ^35, ortópteros (grillos, saltamontes, langostas y saltamontes) ³⁶ y Phthiraptera (piojos) ^37. La aplicación exitosa de RNAi ha proporcionado datos funcionales para el estudio de los patrones en la embriogénesis temprana (eje antero-posterior ^32, eje dorso-ventral ^28, la segmentación ^26,38), la determinación del sexo ^39,40, la biosíntesis de quitina / cutícula ^41, ecdisona señalización ^42, el comportamiento social ^{de 43 años,} y más. Métodos de ARNi desarrollados para diferentes especies de insectos pueden ser de beneficio adicional en que es probable que sea útil para el control de plagas (revisado en ^{44 a 46).} RNAi efectos serán de genes específicos, así como específico de la especie, siempre que las regiones no conservadas se eligen para la orientación. Para las especies de insectos beneficiosos como las abejas y gusanos de seda, dirigidos a los genes vitales para la supervivencia devirus o parásitos para controlar la infección pueden proporcionar una nueva estrategia para proteger estas especies ^47,48.

Dermestes maculatus (D. maculatus), nombre común ocultar escarabajo, se distribuye en todo el mundo a excepción de la Antártida. Como un insecto holometabolous, el ciclo de vida de D. maculatus incluye embrionario, larvas, pupas y adultos etapas (Figura 1). Porque se alimenta de carne, D. maculatus se utiliza en museos para esqueletizar animales muertos y entomólogos forenses se puede utilizar para estimar el tiempo de la muerte ^49,50. D. maculatus se alimenta de productos de origen animal, incluyendo canales, carne seca, queso y las pupas / capullos de otros insectos y por lo tanto causa daño a los hogares, los alimentos almacenados, y la seda, el queso, la carne y las industrias de ^51,52. La aplicación de RNAi en este escarabajo podría proporcionar una forma eficiente y respetuosa con el medio ambiente para reducir al mínimo su impacto económico. Nuestro laboratorio ha utilizado D. maculatus como un nuevo mOdel insectos para estudiar la segmentación ^53. Además de ser susceptible a la cría de laboratorio, D. maculatus es de interés para la investigación básica, ya que es un desarrollador intermedio de gérmenes, por lo que es una especie útil para estudiar la transición entre el desarrollo a corto y largo germen.

Figura 1: Ciclo de vida de D. maculatus. Las fotografías de D. maculatus en diferentes etapas de la vida, como se indica. El ciclo de vida de huevo a adulto dura tres semanas a 30 ° C, pero ya a temperaturas más bajas. (A, F), los embriones recién puestos son de color blanco a amarillo claro y ovalados, de aproximadamente 1,5 mm de longitud. Embriogénesis toma ~ 55 horas a 30 ° C. (B, C y G) Las larvas tienen rayas pigmentadas oscuras y están cubiertas de pelos. Las larvas pasan por varios estadios en función del entorno y su duración puede extenderse hasta más de 1 cm. (D, H) </strong> pupas jóvenes son de color amarillo claro. La pupación tiene ~ 5 – 7 días a 30 ° C. (E, I) Poco después de la eclosión, pigmentación oscura aparece sobre el cuerpo del escarabajo adulto. Los adultos pueden vivir hasta varios meses y una hembra puede poner cientos de embriones durante su vida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Anteriormente, hemos demostrado que el ARNi es eficaz en el derribo de genes en función de D. maculatus ^53. Aquí nuestra experiencia crianza de colonias D. maculatus en el laboratorio es compartido junto con los protocolos de paso a paso, tanto para los padres embrionario y ARNi puesta en marcha, la inyección, la atención post-inyección, y el análisis fenotípico. Los métodos de derribo y análisis de genes mediada por dsRNA introducidos aquí no sólo proporcionar información detallada para abordar cuestiones de D. maculatus, sino que también tienen importancia potencial for la aplicación de RNAi en otros no modelo escarabajo / especies de insectos.