Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için
Summary
Bu rapor, özellikle memeli hücrelerinde hedef genlerin eklenmesini düzenleyen yeni Yapay Ekleme faktörler (ASFS) tasarım ve yapı için biyoteknolojik yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem ayrıca, RNA metabolizması diğer yönlerini işlemek için çeşitli yapay faktörleri mühendisi genişletilebilir.
Abstract
Birçok ökaryotik RNA işleme, özellikle ön-mRNA hedef ve efektör alanına bağlanan bir RNA tanıma modülü, aşağıdakileri içeren modüler bir konfigürasyonları ile Proteins (RBPS) bağlanması RNA aracılık eder. Daha önce, bir RNA metabolizmasını değiştirmek için çeşitli yapay RBPS dizayn etmek için kullanılan bir programlanabilir RNA bağlayıcı iskeleti oluşturmak için insan pumilio 1 PUF alan eşsiz bir RNA bağlanma modu yararlanmaktadır. Burada detaylı bir protokol, spesifik olarak hedef genin alternatif eklemeler modüle etmek üzere tasarlanmış Engineered Ekleme faktörler (ESFs) oluşturmak için tarif edilmektedir. protokol tasarım ve nasıl bir tasarımcı PUF alanını ve bir efektör alan eritme ve nasıl hedef genlerin yapıştırma işlemek için ESFs kullanımı ile bir ESF sentezleme plasmidini inşa etmek üzere özel bir RNA hedefi, için özel bir PUF iskele inşa etmek için de içerir. Bu yöntemin temsili sonuçlar, aynı zamanda yaygın deneyleri tanımlamışlardırEkstraksiyon raportörlerini kullanarak ESF faaliyetlerinin, kültürlenmiş insan hücrelerinde ESF'nin uygulanması ve müteakip ekleme etkisi değişir. Bu rapordaki ayrıntılı protokolleri izleyerek, splicing düzenlemesini ve farklı splicing izoformlarının fonksiyonunu incelemek için yeni bir strateji sağlayarak, farklı Alternatif Ekleme (AS) tiplerinin düzenlenmesi için ESF'ler tasarlamak ve üretmek mümkündür. Üstelik, farklı işlev alanlarını tasarlanmış bir PUF alanı ile kaynaştırarak, araştırmacılar, RNA işlemenin çeşitli aşamalarını manipüle etmek için spesifik RNA'ları hedef alan yapay faktörleri mühendislik yapabilir.
Introduction
En çok insan genleri Alternatif Ekleme (AS), büyük ölçüde genom 1, 2 kodlama karmaşıklığı artmıştır farklı faaliyetleri ile birden fazla izoformu üretmek için tabi tutulur. AS gen fonksiyonunu düzenleyen önemli bir mekanizma sağlar ve sıkıca farklı hücresel ve gelişimsel aşamalarda 3, 4 de farklı yollar aracılığıyla düzenlenir. Ekleme düzen bozukluğu insan hastalığı 5, 6, 7, 8 ortak bir nedenidir olduğundan, ekleme düzenleme hedefleyen çekici bir terapötik yol haline geliyor.
Esas olarak birleştirme arttırıcılar ya da alternatif eksonların susturucu işlevi ön mRNA'da -elemanları sis Ekleme Düzenleme (SRE'ler) tarafından kontrol edilir, AS birleştirme düzenlemenin basitleştirilmiş bir modeline göre. thEse SRE , ekleme reaksiyonunu 3,9 destekleyen veya bastıran çeşitli trans- aktive protein faktörlerini ( yani splicing faktörleri) özellikle işe alır. Çoğu trans- aktive edici ekleme faktörü, splicing'i kontrol etmek için hedeflerini ve efektör alanlarını tanımak için ayrı diziye özgü RNA bağlama alanlarına sahiptir. En iyi bilinen örnekler, ekson ekleme arttırıcıları bağlayan N-terminal RNA Tanıma Motifleri (RRM'ler) ve ekson içeriğini teşvik eden C-terminal RS alanlarını içeren serin / arginin açısından zengin (SR) protein ailesinin üyeleridir . Tersine, hnRNP A1, RRM alanları vasıtasıyla eksonik ekleme susturucularına bağlanır ve bir C-terminali glisin bakımından zengindir domain 11 aracılığıyla ekson içerilmesini engeller. Bu gibi modüler yapılandırmaları kullanarak, araştırmacılar, farklı etki ile belirli bir RNA-Bağlama Alanı (RBD) birleştirerek yapay ekleme faktörleri mühendisliği yapabilmelidirBağlamayı etkinleştiren veya engelleyen alanlar.
Böyle bir tasarımın anahtarı, TALE alanının DNA bağlama moduna benzer programlanabilir RNA bağlanma özgünlüğü ile verilen hedefleri tanıyan bir RBD kullanmaktır. Bununla birlikte, çoğu yerli birleştirme faktörü, zayıf afiniteli kısa RNA elementlerini tanıyan RRM veya K Homology (KH) alanlarını içerir ve dolayısıyla bir "RNA-protein" tanıma koduna sahip değildir12. PUF tekrar proteinlerinin RBD'si ( yani PUF alanı), farklı RNA hedeflerini 13 , 14'ü özel olarak tanıması için PUF alanlarının yeniden tasarımına izin veren benzersiz bir RNA tanıma moduna sahiptir. Kanonik PUF alanı, her biri 8 nt'lik bir RNA hedefinde tek bir tabanı tanıyan sekiz tekrarlar içeren üç α-heliks içerir. İkinci α-sarmalın belirli pozisyonlarındaki amino asitlerin yan zincirleri t nin Watson-Crick kenarı ile spesifik hidrojen bağı oluştururo, her tekrarında (Şekil 1A) RNA bağlanma özgüllüğünü belirleyen temel RNA. PUF tekrar RNA baz tanıması için kod olası 8-baz kombinasyonu (Wei ve Wang 15 tarafından incelenmiştir) tanıyan PUF alan üretimi için izin, (Şekil 1A) şaşırtıcı derecede basittir.
Bu modüler tasarım, ilke, özel PUF etki alanı ve bir ekleme modülasyon alan (yani, bir SR alanı ya da bir Gly-zengini domenindeki) oluşan bir Engineered Ekleme Faktörü (ESF) oluşturulmasına olanak sağlar. Bu ESFs ya birleştirme aktivatörleri olarak ya da ekleme olayların çeşitli kontrol etmek için inhibitörleri olarak işlev görebildikleri ve araçlar insan hastalığı 16, 17 ile ilgili endojen genin eklenmesini işlemek için bu da yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bir örnek olarak, spesifik olarak, BCL-X'e geninin yapıştırma değiştirmek için PUF-Gly-tipi ESFs oluşturduk, Anti-apoptotik uzun izoformu (Bcl-xL) pro-apoptotik kısa izoforma (Bcl-xS) dönüştürmek. Bcl-x izoform oranının değiştirilmesi, birçok kanserli hücrenin çoklu anti-kanser kemoterapi ilaçlarına duyarlı hale getirilmesi için yeterliydi16, bu yapay faktörlerin potansiyel terapötik reaktifler olarak yararlı olabileceğini düşündürüyordu.
Bilinen ekleme efektör alanlarıyla ( örneğin, bir RS veya Gly-zengin alan) yapıştırmayı kontrol etmeye ek olarak, yeni ekleme faktörlerinin aktivitelerini incelemek için mühendislik PUF faktörleri de kullanılabilir. Örneğin, bu yaklaşımı kullanarak, birkaç SR proteininin C-terminal alanının, farklı pre-mRNA bölgelerine 18 bağlandığında splicing'i aktive edebileceğini veya inhibe edebildiğini, RBM4'ün alanin açısından zengin motifinin ekleme 19'u engelleyebileceğini ve DAZAP1'in prolin açısından zengin motifi, eklemeyi artırabilir 20 , 21 </ Sup>. Bu yeni işlevsel alanlar, eklemeyi ince ayar yapmak için ek yapay faktörler türlerini oluşturmak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu rapor özellikle bir hedef genin alternatif eklemeler işleyebilirsiniz yapay ekleme faktörlerinin tasarımı ve inşası için ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu yöntem, özel bir özgüllüğü olan bir RNA bağlayıcı iskeleti oluşturmak için tekrar PUF eşsiz RNA bağlanma modu yararlanır. Ya etkinleştirmek veya yapıştırma bastırmak için kullanılabilir.
Bu protokol dahilinde kritik safha ESFs spesifikliğini tanımlayan reprogramed PUF etki oluşturulmasıdır. Bir P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NIH hibe R01-CA158283 tarafından desteklendi ve NSWB, ZWYW için 31400726 no'lu hibe, Genç Bin Talent Programı ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından finanse edildi (hibe 31471235 ve 81422038). XY, Çin'in doktora sonrası bilim kurumu (2015M571612) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
- Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
- Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
- Wang, G. -. S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
- Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
- Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
- Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -. C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
- Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
- Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
- Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
- Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
- Wang, Y., Cheong, C. -. G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
- Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
- Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
- McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
- Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
- Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
- Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
- Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
- Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
- Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
- He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732 (2009).
- Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
- Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).
- David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
- Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
- Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
- Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).
