Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas
Summary
Este informe describe un método bioingeniería para diseñar y construir nuevos factores de empalme artificiales (ASFS) que modulan específicamente el empalme de genes diana en células de mamífero. Este método se puede ampliar para diseñar diversos factores artificiales para manipular otros aspectos del metabolismo del RNA.
Abstract
El procesamiento de la mayoría de los ARN eucariotas está mediado por RNA Binding Proteins (RBPs) con configuraciones modulares, incluyendo un módulo de reconocimiento de ARN, que se une específicamente a la diana pre-mRNA y un dominio efector. Anteriormente, hemos aprovechado el único modo de unión a ARN del dominio PUF en Pumilio humano 1 para generar un andamio de enlace de ARN programable, que se usó para diseñar varias RBPs artificiales para manipular el metabolismo de ARN. Aquí, un protocolo detallado se describe para construir Engineered Splicing Factors (ESF) que están específicamente diseñados para modular el empalme alternativo de los genes diana. El protocolo incluye cómo diseñar y construir un andamio PUF personalizado para un objetivo de ARN específico, cómo construir un plásmido de expresión de ESF fusionando un dominio PUF diseñador y un dominio efector y cómo usar ESFs para manipular el empalme de genes diana. En los resultados representativos de este método, se han descrito también los ensayos comunesde las actividades del FSE utilizando la prensa de empalme, la aplicación de FSE en células humanas cultivadas, y el posterior efecto de los cambios de empalme. Siguiendo los protocolos detallados en este informe, es posible diseñar y generar ESFs para la regulación de los diferentes tipos de splicing alternativo (AS), que proporciona una nueva estrategia para estudiar la regulación de empalme y la función de diferentes isoformas de empalme. Por otra parte, mediante la fusión de diferentes dominios funcionales con un dominio PUF diseñado, los investigadores pueden diseñar factores artificiales que se dirigen a ARN específicos para manipular diversos pasos de procesamiento del ARN.
Introduction
La mayoría de los genes humanos se someten a splicing alternativo (AS) para producir múltiples isoformas con actividades distintas, que ha aumentado en gran medida la complejidad de codificación del genoma 1, 2. AS proporciona un mecanismo importante para regular la función de genes, y está estrechamente regulada a través de diversas vías en diferentes etapas celular y del desarrollo 3, 4. Debido misregulation empalme es una causa común de la enfermedad humana 5, 6, 7, 8, dirigido a la regulación de empalme está convirtiendo en una ruta terapéutica atractiva.
De acuerdo con un modelo simplificado de la regulación de empalme, AS está controlada principalmente por corte y empalme reguladores cis -Elementos (ERE) en pre-mRNA que funcionan como potenciadores de corte y empalme o silenciadores de exones alternativos. ThSREs ESE reclutan específicamente diversos factores de proteínas que actúan en trans (es decir, factores de empalme) que promueven o inhiben la reacción de corte y empalme 3, 9. La mayoría de los factores de empalme activo en trans tienen dominios de unión de ARN específico de secuencia separados de reconocer sus objetivos y dominios efectores para controlar empalme. Los ejemplos más conocidos son los miembros de la (SR) de la familia de proteínas serina / rico en arginina que contienen ARN de reconocimiento de motivos (EMRR), que se unen exonic splicing enhancers y RS C-terminales dominios N-terminales, que promueven la inclusión del exón 10 . A la inversa, hnRNP A1 se une a silenciadores exonic empalme a través de los dominios RRM e inhibe la inclusión del exón través de un dominio rico en glicina C-terminal 11. El uso de este tipo de configuraciones modulares, los investigadores deben ser capaces de diseñar los factores de empalme artificiales mediante la combinación de una específica de unión al ARN de dominio (RBD) con diferentes efecTor que activan o inhiben el empalme.
La clave de tal diseño es utilizar un RBD que reconoce dadas objetivos con ARN programable vinculante especificidad, que es análoga a la ADN vinculante modo de la TALE dominio. Sin embargo, la mayoría de los factores de empalme nativos contienen RRM o K Homología (KH) dominios, que reconocen los elementos cortos de ARN con afinidad débil y por lo tanto carecen de un predictivo de ARN-proteína de reconocimiento "código" 12 . El RBD de PUF proteínas de repetición ( es decir, el dominio PUF) tiene un único modo de reconocimiento de ARN, lo que permite el rediseño de PUF dominios para reconocer específicamente diferentes ARN objetivos [ 13 , 14] . El dominio PUF canónico contiene ocho repeticiones de tres hélices α, cada una de las cuales reconoce una única base en un objetivo de ARN de 8 nt. Las cadenas laterales de aminoácidos en ciertas posiciones de la segunda hélice-α forman enlaces de hidrógeno específicos con el borde de Watson-Crick de tél ARN base, que determina la especificidad de unión de ARN de cada repetición (Figura 1A). El código de reconocimiento de bases de RNA de la repetición PUF es sorprendentemente simple (Figura 1A), lo que permite la generación de dominios PUF que reconocen cualquier combinación posible 8-base (revisado por Wei y Wang 15).
Este principio de diseño modular permite la generación de un empalme Factor Engineered (FSE) que consiste en un dominio PUF personalizado y un dominio de modulación de empalme (es decir, un dominio de SR o un dominio Gly-ricos). Estos ESFs pueden funcionar ya sea como activadores de empalme o como inhibidores para controlar diversos tipos de eventos de empalme, y que han demostrado ser útiles como herramientas para manipular el empalme de genes endógenos relacionados con la enfermedad humana 16, 17. Como un ejemplo, hemos construido ESFs-de tipo Gly PUF para alterar específicamente el corte y empalme del gen Bcl-x, La conversión de la isoforma larga anti-apoptótica (Bcl-xL) a la pro-apoptótica isoforma corta (Bcl-xS). Desplazamiento de la relación de la Bcl-x isoforma era suficiente para sensibilizar a varias células cancerosas a múltiples fármacos de quimioterapia contra el cáncer 16, lo que sugiere que estos factores artificiales pueden ser útiles como reactivos terapéuticos potenciales.
Además de controlar el empalme con dominios de empalme efectoras conocidos (por ejemplo, una RS o Gly-rico de dominio), los factores de PUF ingeniería también se pueden utilizar para examinar las actividades de los nuevos factores de empalme. Por ejemplo, usando este enfoque, hemos demostrado que el dominio C-terminal de varias proteínas SR puede activar o inhibir empalme cuando la unión a diferentes regiones pre-ARNm 18, que el motivo rico en alanina de RBM4 puede inhibir de empalme 19, y que el motivo rico en prolina de DAZAP1 puede mejorar de empalme 20, 21 </ Sup>. Estos nuevos dominios funcionales se pueden utilizar para construir otros tipos de factores artificiales a splicing afinar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este informe proporciona una descripción detallada para el diseño y construcción de los factores de empalme artificiales que pueden manipular específicamente el corte y empalme alternativo de un gen diana. Este método toma ventaja del modo de unión a la ARN única de PUF repite para producir un andamio de unión al ARN con especificidad personalizado. Se puede utilizar para activar o reprimir empalme.
El paso crítico en este protocolo es la generación del dominio PUF reprogramed que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH R01-CA158283 y la subvención NSFC 31400726 a ZWYW es financiado por el Programa de Young Thousand Talents y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 31471235 y 81422038). XY es financiado por la fundación científica postdoctoral de China (2015M571612).
Materials
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
| PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
References
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