Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

A maioria dos genes humanos sofrer splicing alternativo (AS) para produzir múltiplas isoformas com actividades distintas, o que tem aumentado grandemente a complexidade de codificao do genoma ^{1, 2.} AS fornece um importante mecanismo para regular a funo do gene, e que é fortemente regulada através de diversas vias celulares em diferentes estágios de desenvolvimento e ^{3, 4.} Porque splicing desregulação é uma causa comum de doenças humanas ^{5, 6, 7, 8,} segmentação regulação de splicing é a tornar-se um percurso terapêutico atractivo.

De acordo com um modelo simplificado de regulação de splicing, como é controlada principalmente por splicing Regulatory cis -Elements (SRE) em pré-ARNm que funcionam como intensificadores de splicing ou silenciadores de exs alternativos. ºEstas SREs recrutam especificamente vários fatores de proteína de transação ( isto é, fatores de splicing) que promovem ou suprimem a reação de splicing ^{3 , 9} . A maioria dos fatores de splicing em trans tem domínios de ligação de ARN específicos de seqüência separados para reconhecer seus alvos e domínios efetores para controlar splicing. Os exemplos mais conhecidos são os membros da família de proteínas ricas em serina / arginina (SR) que contêm Motivos de Reconhecimento de RNA N-terminais (RRMs), que se ligam a intensificadores de empasamento exónico e domínios RS C-terminais, que promovem a inclusão de exões ¹⁰ . Inversamente, o hnRNP A1 liga-se a silenciadores de empacotamento exónico através dos domínios RRM e inibe a inclusão do exão através de um domínio rico em glicina C-terminal ¹¹ . Usando tais configurações modulares, os pesquisadores devem ser capazes de criar fatores de splicing artificial combinando um domínio de ligação a RNA específico (RBD) com diferentes efetor domínios que activam ou inibem a splicing.

A chave de um tal desenho é a utilização de um RBD que reconhece dado alvos com especificidade de ligação de ARN programável, que é análogo ao modo de ligação do ADN do domínio história. No entanto, a maioria dos factores de splicing nativas conter RRM ou K Homologia (KH), que reconhecem os domínios elementos de ARN curtos com afinidade fraca e, portanto, carecem de um "código de" reconhecimento de ARN-proteína de previsão ^12. O RBD de proteínas de repetição de PUF (isto é, o domínio PUF) tem um modo de reconhecimento de RNA original, permitindo a remodelação de domínios de PUF para reconhecer especificamente ARN de diferentes alvos ^{13, 14.} O domínio PUF canónica contém oito repetições de três hélices a, cada um reconhecendo um único base num alvo de ARN 8-nt. As cadeias laterais de aminoácidos em certas posições das ligações de hidrogénio específicas segunda forma α-hélice com a borda de Watson-Crick de tele ARN base, que determina a especificidade de ligao de ARN de cada repetição (Figura 1A). O código de reconhecimento de ARN de base da repetição PUF é surpreendentemente simples (Figura 1A), permitindo a geração de domínios de PUF que reconhecem qualquer combinação de 8-base de possível (revisto por Wei Wang e ^15).

Este princípio de construção modular permite a geração de um Factor de Splicing Engineered (FSE) que consiste de um domínio PUF personalizado e um domio de modulao de splicing (isto é, um domínio SR ou um domínio Gli-rico). Estes ESF pode funcionar como activadores de splicing ou como inibidores para controlar vários tipos de eventos de splicing, e que provaram ser úteis como ferramentas para manipular o splicing de genes endógenos relacionados com a doença humana ^{16, 17.} Como um exemplo, nós construímos ESF-Gli-tipo PUF para alterar especificamente o splicing do gene de Bcl-x, Convertendo a isoforma longa anti-apoptótica (Bcl-XL) ao curto isoformas pró-apoptótica (Bcl-XS). Mudando a relação entre a Bcl-x isoforma foi suficiente para sensibilizar várias células cancerosas a múltiplas drogas de quimioterapia anti-cancro ^16, sugerindo que estes fatores artificiais podem ser úteis como reagentes terapêuticos potenciais.

Além de controlar o splicing com domínios splicing efectoras conhecidos (por exemplo, um cabo RS ou domínio Gli-rica), os factores de PUF modificados também podem ser utilizados para examinar as actividades dos novos factores de splicing. Por exemplo, utilizando esta abordagem, que demonstraram que o domínio C-terminal de vias proteas SR pode activar ou inibir o splicing quando se ligarem a diferentes regiões pre-mRNA ^18, que o motivo rico em alanina de RBM4 pode inibir o splicing ^19, e que o motivo rico em prolina de DAZAP1 pode melhorar splicing ^{20, 21 <}/ Sup>. Estes novos domínios funcionais podem ser utilizados para construir os tipos adicionais de fatores artificiais para afinar o splicing.