Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

Die meisten menschlichen Gene werden einem alternativen Spleißen (AS) unterzogen, um mehrere Isoformen mit unterschiedlichen Aktivitäten zu produzieren, was die Kodierungskomplexität des Genoms ^{1 , 2} stark erhöht hat. AS bietet einen wichtigen Mechanismus zur Regulierung der Genfunktion, und es ist eng reguliert durch verschiedene Wege in verschiedenen zellulären und Entwicklungsstadien ^{3 , 4} . Weil das Spleißen der Fehlinformation eine häufige Ursache für die menschliche Erkrankung ist ^{5 , 6 , 7 , 8} , wird die Zielvermehrungsregelung zu einem attraktiven therapeutischen Weg.

Nach einem vereinfachten Modell der Spleißregulierung wird AS hauptsächlich durch Splicing Regulatory cis -Elements (SREs) in Pre-mRNA kontrolliert, die als Spleißverstärker oder Schalldämpfer von alternativen Exons fungieren. ThEse SREs rekrutieren spezifisch verschiedene transaktive Proteinfaktoren ( dh Spleißfaktoren), die die Spleißreaktion ^{3 , 9} fördern oder unterdrücken. Die meisten transaktiven Spleißfaktoren haben separate sequenzspezifische RNA-Bindungsdomänen, um ihre Ziele und Effektordomänen zu erkennen, um das Spleißen zu kontrollieren. Die bekanntesten Beispiele sind die Mitglieder der Serin / Arginin-reichen (SR) Proteinfamilie, die N-terminale RNA-Anerkennungs-Motive (RRMs) enthalten, die exonische Spleißverstärker binden und C-terminale RS-Domänen, die den Exon-Einschluss fördern . Umgekehrt bindet hnRNP A1 an exonische Spleißschalldämpfer durch die RRM-Domänen und hemmt den Exoneinschluss durch eine C-terminale Glycin-reiche Domäne ¹¹ . Mit solchen modularen Konfigurationen sollten Forscher in der Lage sein, künstliche Spleißfaktoren durch die Kombination einer spezifischen RNA-Binding Domain (RBD) mit verschiedenen Effec zu entwickelntor-Domänen, die Splicing aktivieren oder hemmen.

Der Schlüssel für eine solche Gestaltung ist es, eine RBD zu verwenden, die Ziele mit programmierbaren RNA-Bindungsspezifität gegeben erkennt, die an die DNA-Bindungsmodus des TALE Domäne analog ist. Allerdings enthalten die meisten nativen Spleißfaktoren RRM oder K Homology (KH) Domänen, die kurze RNA – Elemente mit schwacher Affinität erkennen und somit fehlt eine prädiktive RNA-Protein – Erkennung „Code“ ^12. Das RBD von PUF repeat Proteinen (dh der PUF – Domäne) hat einen einzigartigen RNA Erkennungsmodus für die Neugestaltung von PUF Domänen ermöglichen spezifisch an verschiedene RNA – Targets ^{13, 14} zu erkennen. Die kanonische PUF Domäne enthält acht Wiederholungen von drei α-Helices, die jeweils eine einzelne Base in einem 8-nt RNA-Ziel zu erkennen. Die Seitenketten der Aminosäuren an bestimmten Positionen der zweiten α-Helix bilden spezifische Wasserstoffbrücken mit dem Watson-Crick Rand ter RNA – Basen, die die RNA – Bindungsspezifität von jedem Rapport (1A) bestimmt. Der Code für die RNA – Basenerkennungs der PUF repeat ist überraschend einfach (Figur 1A), so dass für die Erzeugung von PUF – Domänen , die jeden möglichen 8-Basen – Kombination erkennen (rezensiert von Wei und Wang ^15).

Dieses Baukastenprinzip ermöglicht die Erzeugung eines Engineered Splicing Factor (ESF), die aus einer angepassten PUF – Domäne und einer Spleiß – Modulations Domäne (also eine SR – Domäne oder eine Gly-reichen Domäne) besteht. Diese ESFs funktionieren kann entweder als Splicing Aktivatoren oder als Inhibitoren auf verschiedene Arten von Spleißereignisse zu steuern, und sie haben sich bewährt , als Werkzeuge , um das Spleißen endogener Gene zu manipulieren , ¹⁶ für die menschliche Krankheit ^{verbundenen, 17.} Als Beispiel haben wir PUF-Gly-Typ-ESFs konstruiert, um speziell das Spleißen des Gens Bcl-x zu verändernDie anti-apoptotische lange Isoform (Bcl-xL) an die pro-apoptotische kurze Isoform (Bcl-x S) umzuwandeln. Eine Verschiebung des Verhältnisses der Bcl-x – Isoform war ausreichend , um mehrere Krebszellen mehr Anti-Krebs – Chemotherapie – Medikament ^16, zu sensibilisieren darauf hindeutet , dass diese künstlichen Faktoren als potentielle therapeutische Reagenzien nützlich sein können.

Zusätzlich Spleißen mit bekannten Spleißen Effektordomänen zu steuern (beispielsweise eine RS oder Gly-reiche Domäne) kann die engineered PUF Faktoren auch die Aktivitäten des neuen Spleißfaktoren zu untersuchen , verwendet werden. Zum Beispiel kann bei Verwendung dieses Ansatzes haben wir gezeigt , dass die C-terminale Domäne von mehreren SR – Proteine aktivieren oder Splicing hemmen , wenn auf verschiedene prä-mRNA – Bereiche ^18, dass das Alanin-reiches Motiv von RBM4 Bindung kann Splicing ^19, hemmen , und dass das Prolin-reiches Motiv DAZAP1 kann ²⁰ Spleißen ^{verbessern, 21 <}/ Sup>. Diese neuen funktionellen Domänen können verwendet werden, um zusätzliche Arten von künstlichen Faktoren Feinabstimmung Spleißen zu konstruieren.