Facteurs artificiels artificiels pour manipuler spécifiquement l'épissage alternatif dans les cellules humaines

La plupart des gènes humains subissent Alternative Splicing (AS) pour produire des isoformes multiples avec des activités distinctes, ce qui a considérablement augmenté la complexité du codage du génome ^{1, 2.} AS fournit un mécanisme important pour réguler la fonction des gènes, et il est étroitement régulée par des voies différentes à différents stades cellulaires et de développement ^{3, 4.} Parce que l' épissage misregulation est une cause fréquente de la maladie humaine ^{5, 6, 7, 8,} ciblage régulation de l' épissage devient une voie thérapeutique intéressante.

Selon un modèle simplifié de la régulation de l' épissage, comme cela est principalement contrôlée par épissage cis Regulatory -elements (SRE) dans le pré-ARNm qui fonctionnent comme activateurs d'épissage d'exons ou des silencieux de remplacement. thSRE ese recruter spécifiquement divers facteurs protéiques trans -acting ( à savoir les facteurs d'épissage) qui favorisent ou inhibent la réaction d'épissage ^{3, 9.} La plupart des facteurs d'épissage trans -acting ont des domaines de liaison d'ARN spécifiques de séquence distincts pour reconnaître leurs cibles et domaines effecteurs pour contrôler l' épissage. Les exemples sont les membres de la sérine / riche en arginine (SR) de la famille de protéines qui contiennent de l' ARN N-terminaux de reconnaissance motifs (RRMS), qui se lient activateurs d'épissage d' exons, et des domaines RS C-terminaux, qui favorisent l' inclusion de l' exon ¹⁰ les plus connus . A l' inverse, hnRNP A1 se lie à des silencieux d'épissage d' exons dans les domaines RRM et inhibe l' inclusion de l' exon à travers un domaine riche en glycine C-terminal ^11. L'utilisation de ces configurations modulaires, les chercheurs devraient être en mesure de concevoir des facteurs d'épissage artificiels en combinant un domaine ARN liaison spécifique (RBD) avec différents effecdomaines tor qui activent ou inhibent l'épissage.

La clé d'une telle conception consiste à utiliser un RBD qui reconnaît les cibles donné avec une spécificité de liaison d'ARN programmable, qui est analogue au mode de liaison à l'ADN du domaine CONTE. Cependant, la plupart des domaines contiennent des facteurs d'épissage RRM ou K Homologie (KH) natifs, qui reconnaissent des éléments d'ARN courts avec une faible affinité , et donc un manque de reconnaissance prédictive d'ARN-protéine « code » ^12. Le RBD des protéines de répétition MPU ( à savoir le domaine PUF) dispose d' un mode de reconnaissance de l' ARN unique, permettant pour la refonte des domaines PUF de reconnaître spécifiquement l' ARN cibles différentes ^{13, 14.} Le domaine PUF canonique contient huit répétitions de trois hélices a, en reconnaissant chacun une base unique dans une cible d'ARN de 8 nt. Les chaînes latérales des acides aminés à certaines positions des secondes liaisons hydrogène spécifiques forment α-hélice avec le bord de Watson-Crick de tLa base d'ARN, qui détermine la spécificité de liaison de l'ARN de chaque répétition ( figure 1A ). Le code pour la reconnaissance par ARN de la répétition PUF est étonnamment simple ( Figure 1A ), permettant la génération de domaines PUF qui reconnaissent toute combinaison possible de 8 bases (examinée par Wei et Wang ¹⁵ ).

Ce principe de conception modulaire permet la génération d'un Factor d'épissage Engineered (ESF) qui consiste en un domaine PUF personnalisé et un domaine de modulation d'épissage ( c'est-à-dire un domaine SR ou un domaine riche en Gly). Ces ESF peuvent fonctionner comme activateurs d'épissage ou comme inhibiteurs pour contrôler différents types d'événements d'épissage, et ils se sont révélés utiles comme outils pour manipuler l'épissage des gènes endogènes liés à la maladie humaine ^16,17 . Par exemple, nous avons construit des ESF de type PUF-Gly pour modifier spécifiquement l'épissage du gène Bcl-x, La conversion de l'isoforme longue anti-apoptotique (Bcl-xL) en isoforme courante pro-apoptotique (Bcl-xS). Le changement du rapport de l'isoforme Bcl-x était suffisant pour sensibiliser plusieurs cellules cancéreuses à de multiples médicaments contre la chimiothérapie anticancéreux ¹⁶ , ce qui suggère que ces facteurs artificiels peuvent être utiles en tant que réactifs thérapeutiques potentiels.

En plus de contrôler l'épissage avec des domaines effecteurs d'épissage connus ( par exemple, un domaine RS ou Gly), les facteurs PUF modifiés peuvent également être utilisés pour examiner les activités de nouveaux facteurs d'épissage. Par exemple, en utilisant cette approche, nous avons démontré que le domaine C-terminal de plusieurs protéines SR peut activer ou inhiber l'épissage lors de la liaison à différentes régions pré-ARNm ¹⁸ , que le motif riche en alanine de RBM4 peut inhiber l'épissage ¹⁹ et Le motif riche en proline de DAZAP1 peut améliorer l'épissage ^{20 , 21 <}/ Sup>. Ces nouveaux domaines fonctionnels peuvent être utilisés pour construire des types supplémentaires de facteurs artificiels pour affiner l'épissage.