Identificação de ácidos graxos no<em> Bacillus cereus</em
Summary
We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).
Abstract
As espécies de Bacillus contêm cadeia ramificada e ácidos graxos insaturados (FAS), com diversas posições do ramo de metilo (ISO ou anteiso) e da ligação dupla. Alterações na composição da FA desempenha um papel crucial na adaptação de bactérias ao seu ambiente. Estas modificações implicar uma mudança na proporção de iso contra anteiso ramificada CC, e na proporção de CC insaturado em relação ao FAS saturado, com ligações duplas em posições específicas criadas. Identificação precisa do perfil FA é necessário compreender os mecanismos de adaptação de espécies de Bacillus.
Muitas das FAs de Bacillus não estão comercialmente disponíveis. A estratégia aqui proposto identifica CC através da combinação de informação sobre o tempo de retenção (por cálculo do comprimento de cadeia equivalente (ECL)) com o espectro de massa de três tipos de derivados FA: ésteres metílicos de ácido gordo (FAMEs), 4,4-dimetil-oxazolina derivados (DMOX), eéster de 3-pyridylcarbinyl (picolinilo). Este método pode identificar os CC sem a necessidade de purificar o CC desconhecido.
Comparando os perfis cromatográficos de FAME preparado a partir de Bacillus cereus com uma mistura comercial de padrões permite a identificação de cadeia linear-CC, o cálculo da ECL, e saturada hipóteses sobre a identidade da outra FAs. FAMEs saturado ramificado de CC, iso ou anteiso, exibir uma mudança negativa constante no ECL, em comparação ao FAS lineares saturados com o mesmo número de carbonos. FAMEs do FAS insaturado pode ser detectada pela massa dos seus iões moleculares, e conduzir a uma mudança positiva na LCE em relação ao FAS saturados correspondentes.
A posição de ramificação de AF e a posição da ligação dupla CC insaturado pode ser identificado por espectros de massa de ionização de electrões de derivados de picolinilo e DMOX, respectivamente. Esta abordagem identifica todo o ramo saturado desconhecidoed FAs, insaturados de cadeia linear FAs e AF ramificados insaturados a partir do extrato de B. cereus.
Introduction
cromatografia de ácido gordo metil éster (FAME) gasosa (GC) é um método essencial para a caracterização de lípidos. Ele separa rapidamente e quantifica os vários ácidos gordos (FAS) de uma amostra após um curto passo de extracção. Os derivados de ésteres de metilo são altamente voláteis, estável e inerte no sentido da coluna cromatográfica, evitando desse modo os picos de decantação. A sua identificação é bastante simples quando a amostra é constituída por FAs bem conhecidas porque os perfis cromatográficos são publicados nem em relação aos padrões. Além disso, a injecção repetida de padrões de calibração para a quantificação de diferentes FAs não é necessário, devido à sua resposta quase constante para a detecção de ionização de chama (FID) 1.
Além FID, espectrometria de massa de detecção (MS) fornece um conjunto complementar de informações para confirmar FAMEs. No entanto, quando EMAGs são cobrados através de ionização de elétrons (EI), os espectros resultantes nem sempre permitem the identificação de estrutura fina FA. Por exemplo, a posição de ramificação (isto é, um grupo metilo ramificado) é difícil prever porque os iões de diagnóstico são difíceis de detectar uma característica e a alteração na abundância de iões alvo é dependente da máquina, evitando a utilização de espectros de massa bibliotecas 2. Outro desafio está em identificar a posição ligação dupla porque EI provoca a migração ligação dupla. Assim, isómeros FA com diferentes posições de ligação dupla não pode ser diferenciados pelo seu espectro de massa. Felizmente, outras ferramentas têm sido desenvolvidos para a identificação FA. Por exemplo, a presença e a posição de ramificação ou de ligações duplas em FAs pode ser conjecturado calculando o comprimento de cadeia equivalente (ECL) 3.
Outros métodos de derivatização resultar em diferentes espectros de massa, dependente da localização de uma ligação dupla ou um grupo metilo ramificado. 4,4-dimetil derivados oxazolina (DMOX) 4 permitem easY identificação da posição das ligações duplas de ácidos gordos monoinsaturados. 3-pyridylcarbinyl éster (éster picolinil) derivados de permitir uma identificação inequívoca da localização de metilo ramificado CC 5. Combinando retenção cromatográfica (ECL) e espectro de massa (DMOX e picolinil) informação permite a identificação da maioria dos CC sem a necessidade de utilizar métodos de complexos de purificação, tal como exigido para a ressonância magnética nuclear (RMN) do espectro, o método incontestável para a caracterização estrutural 1 .
As bactérias do gênero Bacillus, que incluem alguns patógenos humanos e animais, são capazes de colonizar muito diversos nichos e são, portanto, amplamente distribuído no ambiente 6. Entre o género Bacillus, a composição de FA é influenciada pela nicho ecológico das espécies com modulações nos padrões de FA para se adaptar a uma vasta gama de mudanças ambientais (por exemplo, meio de crescimento, temperatura,pH, etc.) 7-9. Devido à relativa homogeneidade do padrão de FA em várias espécies do género Bacillus durante o crescimento em condições padronizadas, a determinação da composição de FA é um dos critérios essenciais utilizados para definir as espécies de Bacillus. Um atributo exclusivo do gênero Bacillus é a abundância de FAs de cadeia ramificada contendo 12-17 carbonos 10-12 com a relação entre a ISO e Anteiso isômeros sendo um factor determinante da adaptação às condições ambientais. As espécies de Bacillus também adaptar-se a variações ambientais, alterando a proporção de ácidos gordos insaturados. Em algumas espécies, tais como Bacillus cereus, duas dessaturases ácidos graxos criar ligações duplas em diferentes posições da cadeia de alquilo 13 com diferentes papéis na adaptação 9. O exemplo do género Bacillus ilustra a importância de identificar precisamente a posição da ligação dupla e FA ramificação. coletarvamente, a identificação de padrões de Bacillus FA tem várias aplicações úteis. Aqui, nós propomos uma nova abordagem GC-MS para Bacillus FA identificação padrão que supera as limitações inerentes de uma análise de GC-MS clássica.
Esta abordagem inovadora pode ser utilizado directamente no material biológico em bruto, e é composto de uma combinação de técnicas existentes: informações sobre os tempos de retenção (ECL) e espectros de massa de derivados de diferentes FAs (FAME, DMOX e éster-picolinil).
Nós usamos a seguinte FA nomenclatura. I, A, e n indicam iso, Anteiso metil ramificada, e ácido gordo de cadeia linear, respectivamente. CC insaturadas foram nomeados por C: d em que C é o número de átomos de carbono no ácido gordo e d é o número de ligações duplas. Δ x indica a posição da ligação dupla, em que a ligação dupla está localizada na ligação carbono-carbono Xth, contando a partir da extremidade de ácido carboxílico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os perfis de cromatogramas FAs mostrados na Tabela 1 correspondem a B. cereus ATCC 14579 cresceram em uma superfície da placa de agar. Perfis semelhantes foram obtidos quando a bactéria foi cultivada em meio líquido gaseificado à mesma temperatura 8. No caso de bactérias cultivadas em meio líquido, a biomassa bacteriana é recolhido por centrifugação do meio de crescimento e podem ser lavados de acordo com protocolos anteriormente descritos, dependendo das condições de cres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos a Thomas Mison por seu apoio técnico, e Rachel Kopec para a revisão do manuscrito.
Materials
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m x 0.25mm x 0.25µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
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