脂肪酸の同定で<em>セレウス菌</em
Summary
We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).
Abstract
バチルス種は、メチル分岐（イソまたはアンテイソ）の二重結合の多様な位置で分枝鎖不飽和脂肪酸（FAS）を含みます。 FA組成の変化は、環境への細菌の適応において重要な役割を果たしています。これらの変更は、イソ対アンテイソの比率の変化を伴う特定の位置に作成された二重結合を有する、FAの分枝、飽和のFAへの不飽和のFAの割合インチFAプロファイルの正確な同定は、 バチルス種の適応メカニズムを理解する必要があります。
バチルスからのFAの多くは市販されていません。脂肪酸メチルエステル（FAME）、4,4-ジメチルオキサゾリン：本明細書で提案された戦略は、FA誘導体の3種類の質量スペクトルと保持時間（等価な鎖長（ECL）の計算によって）情報を組み合わせてのFAを識別するデリバティブ（DMOX）、および3 pyridylcarbinylエステル（ピコリニル）。この方法は、未知のFAを精製する必要なしのFAを識別することができます。
標準の商業用混合物とセレウス菌から調製したFAMEのクロマトグラフィープロファイルを比較すると、他のFAのアイデンティティにするFA、ECLの計算、および仮説を飽和直鎖の同定を可能にします。分岐飽和のFA、イソまたはアンテイソのFAMEを、同じ数の炭素を有する直鎖飽和のFAに比べECLに一定の負のシフトを、表示します。不飽和のFAのFAMEをその分子イオンの質量によって検出され、対応する飽和のFAに比べECLにおける正のシフトをもたらすことができます。
FAの分岐位置及び不飽和のFAの二重結合の位置は、それぞれ、ピコリニルとDMOX誘導体の電子イオン化マススペクトルによって同定することができます。このアプローチは、すべての未知飽和の分岐を識別するEDのFA、不飽和直鎖状のFAおよびセレウス菌の抽出物から不飽和分枝状のFA。
Introduction
脂肪酸メチルエステル（FAME）、ガスクロマトグラフィー（GC）は、脂質の特性評価に不可欠な方法です。それは急速に分離し、短い抽出工程後の試料の様々な脂肪酸（FAS）を定量化します。メチルエステルの誘導体は、クロマトグラフィーカラムに向かって高度に揮発性の安定かつ不活性であり、それによってテーリングピークを回避します。クロマトグラフィーのプロファイルはいずれかの公開や標準に比較されるため、サンプルは、周知のFAで構成されている場合、それらの識別はかなり簡単です。加えて、様々なのFAの定量化のための較正標準の反復注射は、炎イオン化検出器（FID）1へのほぼ一定の応答を考えると、必要とされません。
FIDに加えて、質量分析（MS）検出のFAMEを確認するために情報の補完的なセットを提供します。 FAMEは、電子イオン化（EI）を使用して充電されたときしかし、得られるスペクトルは、常に目のために許可されていませんFA微細構造の電子識別。診断イオンが1を検出することが困難であり、ターゲットイオン存在量の特性変化は、質量スペクトルライブラリー2を使用することを防止する、機械に依存するので、例えば、位置分岐（ すなわち、分岐したメチル基）を予測することは困難です。もう一つの課題は、EIは、二重結合の移動が発生するため、二重結合の位置を特定することにあります。このように、二重結合の位置を変化させたFA異性体は、その質量スペクトルによって区別することはできません。幸いなことに、他のツールは、FAの同定のために開発されています。例えば、存在およびFASにおける二重結合のまたは分岐の位置は、等価な鎖長（ECL）3を計算することによって推測することができます。
他の誘導体化方法は、二重結合または分枝鎖のメチル基の位置に依存する異なる質量スペクトルをもたらします。 4,4-ジメチルオキサゾリン誘導体（DMOX）4 EASを可能に一価不飽和脂肪酸の二重結合の位置のyの識別。 3-pyridylcarbinylエステル（ピコリニルエステル）誘導体は、Fas 5分枝鎖メチルの場所の明確な同定を可能にします。核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、構造的特徴1争う余地のない方法の必要に応じて、精製の複雑な方法を使用することなく、クロマトグラフィーの保持（ECL）および質量スペクトル（DMOXとピコリニル）情報は、ほとんどのFAの同定を可能にする合成。
いくつかのヒトおよび動物の病原体を含むバチルス属の細菌は、非常に多様なニッチにコロニーを形成することが可能であるため、広く環境6に分布しています。 バチルス属の中でも、FA組成物は、環境の変化（ 例えば 、増殖培地、温度の広い範囲に適応するためにFAパターンの変調を有する種の生態的地位に影響されますpHは、 等 ）7-9。そのため標準化された条件で成長中のバチルス属の種間FAパターンの相対的な均質性、FA組成物の決意は、 バチルス種を定義するために使用される本質的な基準の一つです。 バチルス属のユニークな属性は、ISOおよび環境条件への適応の重要な決定要因であることアンテイソ異性体間の比で12-17個の炭素10-12を含む分岐鎖のFAの豊富さです。 バチルス種はまた、不飽和脂肪酸の比率を変えることにより、環境変動に適応します。このようなセレウス菌などのいくつかの種では、2脂肪酸デサチュラーゼは、適応9で異なる役割を持つアルキル鎖13の異なる位置に二重結合を作成します。 バチルス属の例は、正確に二重結合の位置を識別し、FAは、分岐の重要性を示しています。収集しますively、 バチルス FAパターンの同定は、いくつかの有用な用途を有します。ここで、我々は、古典的なGC-MS分析の固有の限界を克服するバチルス FAパターン識別のための新規なGC-MSの方法を提案します。
この革新的なアプローチは、生の生物学的物質に直接使用し、既存の技術の組み合わせで構成することができます。保持時間（ECL）の情報と異なるのFA誘導体（FAME、DMOXとピコリ – エステル）の質量スペクトル。
当社は、以下のFA命名法を使用しています。 I、およびnは、それぞれISO、アンテイソメチル分枝、直鎖脂肪酸を示します。不飽和のFAは、Cによって指定された：Cであり、Dは、脂肪酸およびD中の炭素原子の数は、二重結合の数です。 Δxは 、二重結合は、カルボン酸末端から数えて、x番目の炭素-炭素結合上に位置する二重結合の位置を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
表1に示したのFAクロマトグラムプロファイルは、寒天プレートの表面上に成長させたB.セレウス ATCC 14579に対応します。細菌が同じ温度8で通気し、液体培地中で増殖させた場合にも同様のプロファイルが得られました。液体培地中で増殖させた細菌の場合には、細菌バイオマスの増殖培地の遠心分離によって回収し、成長条件8,19によって以前?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は原稿の改訂のための彼の技術サポートのために、とレイチェルKopecにトーマスMisonに感謝しています。
Materials
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m x 0.25mm x 0.25µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
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