Identificazione di acidi grassi a<em> Bacillus cereus</em
Summary
We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).
Abstract
Le specie Bacillus contengono ramificata catena e acidi grassi insaturi (FAS) con diverse posizioni del ramo di metile (ISO o anteiso) e del doppio legame. Cambiamenti nella composizione FA giocano un ruolo cruciale nell'adattamento dei batteri al loro ambiente. Queste modifiche comportano una variazione del rapporto di iso rispetto anteiso ramificato AF, e nella proporzione di insaturo FAs rispetto al satura AF, con doppi legami creati in posizioni specifiche. Identificazione precisa del profilo di FA è necessario comprendere i meccanismi di adattamento di specie Bacillus.
Molte delle federazioni da Bacillus non sono disponibili in commercio. La strategia proposta nel presente documento identifica FAs combinando le informazioni sul tempo di ritenzione (calcolo della lunghezza della catena equivalente (ECL)), con gli spettri di massa di tre tipi di derivati FA: gli esteri metilici degli acidi grassi (FAME), 4,4-dimetil ossazolinici derivati (DMOX), e3-pyridylcarbinyl estere (picolinyl). Questo metodo può identificare FAS senza la necessità di purificare l'ignoto AF.
Confrontando i profili cromatografici di FAME preparato da Bacillus cereus con una miscela commerciale di standard consente l'identificazione di catena lineare saturo AF, il calcolo della ECL, e ipotesi sull'identità dell'altro AF. FAMEs di ramificata saturi Federcalcio, iso o anteiso, visualizzare un cambiamento negativo costante nella ECL, rispetto alla FAS lineari saturi con lo stesso numero di atomi di carbonio. FAMEs di insaturo AF possono essere rilevati dalla massa dei loro ioni molecolari, e determinano uno spostamento positivo nella ECL rispetto ai corrispondenti federazioni saturi.
La posizione ramificazione del FAS e la posizione del doppio legame insaturi FAs possono essere identificati dagli spettri di massa a ionizzazione di elettroni picolinyl e DMOX derivati, rispettivamente. Questo approccio identifica tutto il ramo saturo sconosciutaEd FAs, insaturi a catena lineare FAs e AF ramificati insaturi dall'estratto cereus B..
Introduction
Acidi grassi gascromatografia estere metilico (FAME) (GC) è un metodo essenziale per la caratterizzazione dei lipidi. Si separa rapidamente e quantifica i vari acidi grassi (FAS) di un campione dopo una breve fase di estrazione. Derivati di esteri metilici sono altamente volatili, stabile ed inerte verso la colonna cromatografica, evitando così i picchi di decantazione. La loro identificazione è piuttosto semplice quando il campione è costituito da FAs ben noti in quanto i profili cromatografici o sono pubblicati o rispetto agli standard. Inoltre, l'iniezione ripetuta di standard di calibrazione per la quantificazione di vari FAs non è necessario, data la loro pressoché costante risposta al rilevamento a ionizzazione di fiamma (FID) 1.
Oltre a FID, spettrometria di massa (MS) di rilevamento fornisce una serie complementare di informazioni per confermare FAMEs. Tuttavia, quando FAMEs pagano usando ionizzazione elettronica (EI), gli spettri risultanti non sempre consentono °e l'identificazione di FA struttura fine. Per esempio, la posizione ramificazione (cioè, un gruppo metile ramificato) è difficile da prevedere perché gli ioni diagnostici sono difficili da rilevare 1 e il cambiamento caratteristico in abbondanza ione bersaglio dipende dalla macchina, evitando l'uso di librerie di spettri di massa 2. Un'altra sfida consiste nell'individuare la posizione di doppio legame, perché EI provoca la migrazione doppio legame. Così, isomeri FA con diverse posizioni doppio legame non possono essere differenziati per la loro spettri di massa. Fortunatamente, altri strumenti sono stati sviluppati per l'identificazione FA. Per esempio, la presenza e la posizione di ramificazione o di doppi legami in FAs ipotizzabile calcolando la lunghezza della catena equivalente (ECL) 3.
Altri metodi di derivatizzazione comportano diversi spettri di massa, dipende dalla posizione di un doppio legame o un gruppo metile ramificato. 4,4-dimetil derivati ossazolinici (DMOX) 4 permettono di easIdentificazione y della posizione di doppi legami di acidi grassi monoinsaturi. 3-pyridylcarbinyl estere (picolinyl estere) i derivati permettono l'identificazione univoca della posizione di metile ramificata FAs 5. Combinando ritenzione cromatografica (ECL) e spettrometria di massa (DMOX e picolinyl) informazioni consente l'identificazione della maggior parte delle federazioni senza la necessità di utilizzare complessi metodi di purificazione, come richiesto per la risonanza magnetica nucleare (NMR), il metodo incontestabile per la caratterizzazione strutturale 1 .
I batteri del genere Bacillus, che include alcuni agenti patogeni umani ed animali, sono in grado di colonizzare estremamente diverse nicchie e sono quindi ampiamente distribuiti nell'ambiente 6. Tra genere Bacillus, composizione FA è influenzata dalla nicchia ecologica della specie con modulazioni nei modelli FA di adattarsi ad un'ampia gamma di cambiamenti ambientali (ad esempio, il terreno di coltura, la temperatura,pH, ecc) 7-9. A causa della relativa omogeneità del modello FA attraverso specie del genere Bacillus durante la crescita in condizioni standardizzate, determinazione della composizione FA è uno dei criteri essenziali usati per definire le specie Bacillus. Un attributo unico del genere Bacillus è l'abbondanza del FAS a catena ramificata contenenti 12-17 atomi di carbonio 10-12 con il rapporto tra ISO e anteiso isomeri di essere un fattore determinante di adattamento alle condizioni ambientali. Specie Bacillus adattano anche alle fluttuazioni ambientali alterando la percentuale di acidi grassi insaturi. In alcune specie, come il Bacillus cereus, due desaturasi di acidi grassi creano doppi legami in diverse posizioni della catena alchilica 13 con diversi ruoli in adattamento 9. L'esempio del genere Bacillus illustra l'importanza di individuare con precisione la posizione doppio legame e FA ramificazione. Collezionarevamente, l'identificazione di modelli di Bacillus FA ha diverse applicazioni utili. Qui, proponiamo un nuovo approccio GC-MS per l'identificazione modello Bacillus FA che supera i limiti intrinseci di una classica analisi GC-MS.
Questo approccio innovativo può essere utilizzato direttamente sul materiale biologico grezzo, e consiste in una combinazione di tecniche esistenti: informazioni sui tempi di ritenzione (ECL) e spettri di massa dei diversi derivati AF (FAME, DMOX e picolinyl-estere).
Usiamo la seguente nomenclatura FA. i, a, e n indicano iso, anteiso metil ramificata, e acidi grassi a catena lineare, rispettivamente. FAs insaturi sono stati nominati da C: d dove C è il numero di atomi di carbonio dell'acido grasso e d è il numero di doppi legami. Δ x indica la posizione del doppio legame, in cui il doppio legame è situato il legame carbonio-carbonio xth, contando dal terminale acido carbossilico.
Protocol
Representative Results
Discussion
I profili cromatogramma AF indicati nella tabella 1 corrispondono a B. cereus ATCC 14579 cresciuta su una superficie della piastra di agar. Profili simili sono stati ottenuti quando il batterio è stato coltivato in terreni liquidi aerato alla stessa temperatura 8. Nel caso dei batteri coltivati in terreno liquido, la biomassa batterica viene raccolto per centrifugazione del mezzo di crescita e può essere lavato secondo protocolli precedentemente descritti a seconda delle condizioni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati a Thomas Mison per il suo supporto tecnico, e di Rachel Kopec per la revisione del manoscritto.
Materials
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m x 0.25mm x 0.25µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
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