Identifizierung von Fettsäuren in<em> Bacillus cereus</em
Summary
We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).
Abstract
Die Bacillus – Arten enthalten Kette und ungesättigte Fettsäuren (FAs) mit unterschiedlichen Positionen der Methylverzweigung verzweigten (iso oder anteiso) und der Doppelbindung. Änderungen in FA Zusammensetzung, die eine entscheidende Rolle bei der Anpassung der Bakterien an ihre Umgebung zu spielen. Diese Modifikationen beinhalten eine Änderung in dem Verhältnis von iso gegen anteiso FAs verzweigt, und der Anteil an ungesättigten FAs relativ zu gesättigten FAs mit Doppelbindungen an spezifischen Positionen erstellt. Genaue Identifizierung des FA Profil ist notwendig , um die Anpassungsmechanismen von Bacillus – Spezies zu verstehen.
Viele der FAs von Bacillus sind nicht im Handel erhältlich. Die vorgeschlagene Strategie identifiziert hierin FAs von Informationen über die Retentionszeit (Berechnung der äquivalenten Kettenlänge (ECL)) mit den Massenspektren von drei Arten von FA-Derivaten kombiniert: Fettsäuremethylester (FAME), 4,4-Dimethyl-oxazolin Derivate (DMOX) und3-pyridylcarbinyl Ester (Picolinyl). Diese Methode kann die FAs ohne die Notwendigkeit erkennen, das Unbekannte FAs zu reinigen.
Vergleichen chromatographischen Profile von FAME hergestellt aus Bacillus cereus mit einem handelsüblichen Gemisch von Standards ermöglicht die Identifizierung von geradkettigen gesättigten FAs, die Berechnung der ECL, und Hypothesen über die Identität des anderen FAs. im Vergleich zu linearen gesättigten FAs mit der gleichen Anzahl von Kohlenstoffatomen FAMEs verzweigter gesättigter FAs, iso oder anteiso, in der ECL, eine konstante negative Verschiebung anzuzeigen. FAMEs ungesättigter FAs kann durch die Masse ihrer Molekülionen, und führen zu einer positiven Verschiebung der ECL im Vergleich zu den entsprechenden gesättigten FAs detektiert werden.
Die Verzweigungsposition von Fas und die Doppelbindung Position von ungesättigten FAs kann durch die elektronen Ionisations-Massenspektren von Picolinyl und DMOX Derivate bzw. identifiziert werden. Dieser Ansatz identifiziert die unbekannten gesättigten Zweiged FAs, ungesättigte geradkettige FAs und ungesättigte verzweigte FAs aus dem cereus Extrakt B..
Introduction
Fettsäuremethylester (FAME), Gaschromatographie (GC) ist ein wesentliches Verfahren zur Lipid Charakterisierung. Sie trennt sich rasch und quantifiziert die verschiedenen Fettsäuren (FAs) einer Probe nach einer kurzen Extraktionsschritt. Derivate von Methylester sind sehr volatil, stabil und inert gegenüber der chromatographischen Säule, wodurch vermieden wird Tailing Spitzen. Ihre Identifizierung ist ziemlich einfach, wenn die Probe von bekannten FAs besteht, weil die chromatographischen Profile entweder veröffentlicht oder im Vergleich zu Standards. Darüber hinaus ist die wiederholte Injektion von Kalibrierungsstandards zur Quantifizierung verschiedener FAs nicht erforderlich, da die fast konstante Reaktion auf Flammenionisationsdetektion (FID) 1.
Neben FID stellt Massenspektrometrie (MS) Detektion einer komplementären Reihe von Informationen zu FAME bestätigen. Wenn jedoch FAMEs berechnet werden unter Verwendung Elektronenionisation (EI), die resultierenden Spektren erlauben nicht immer für the Identifizierung von FA Feinstruktur. Beispielsweise Verzweigungsposition (dh eine verzweigte Methylgruppe) ist schwer vorherzusagen , da die diagnostische Ionen schwer 1 und die charakteristische Änderung Ionenabundanz in Ziel zu erfassen ist maschinenabhängig, was die Verwendung von Massenspektren Bibliotheken 2 verhindert wird . Eine weitere Herausforderung liegt in der Doppelbindung Position zu identifizieren, weil EI-Doppelbindung Migration verursacht. So FA Isomere mit Doppelbindung Positionen unterschiedlicher nicht durch ihre Massenspektren unterschieden werden. Glücklicherweise andere Werkzeuge wurden für FA Identifikation entwickelt. Zum Beispiel kann die Anwesenheit und die Position oder der Doppelbindungen in FAs Verzweigungs kann durch Berechnen der äquivalenten Kettenlänge (ECL) 3 gemutmaßt werden.
Andere Derivatisierung Verfahren führen zu unterschiedlichen Massenspektren, abhängig von der Position einer Doppelbindung oder einer verzweigten Methylgruppe ist. 4,4-Dimethyl oxazolinderivaten (DMOX) 4 ermöglichen easy Identifizierung der Position der einfach ungesättigten Fettsäure-Doppelbindungen. 3-pyridylcarbinyl ester (Picolinyl ester) Derivate zur eindeutigen Identifizierung der Lage von Methyl ermöglichen verzweigten FAs 5. Kombination von chromatographischen Retention (ECL) und Massenspektren (DMOX und Picolinyl) Information erlaubt die Identifizierung der meisten FAs ohne die Notwendigkeit , komplexe Reinigungsverfahren zu verwenden, wie 1 für die Kernspinresonanz (NMR) -Spektrum, das unhinterfragbares Methode zur strukturellen Charakterisierung erforderlich .
Bakterien der Gattung Bacillus, die einige menschliche und tierische Pathogene umfassen, können sehr unterschiedliche Nischen zu kolonisieren und werden daher in der Umwelt weit 6 verteilt. Unter der Gattung Bacillus, der Zusammensetzung FA durch die ökologische Nische der Spezies mit Modulationen in FA Muster beeinflusst zu einem breiten Spektrum von Umgebungsänderungen (zB Wachstumsmedium, Temperatur, anzupassenpH, etc.) 7-9. Aufgrund der relativen Homogenität des FA Muster über Spezies der Gattung Bacillus während des Wachstums in standardisierten Bedingungen, Bestimmung der FA Zusammensetzung ist eines der wesentlichen Kriterien verwendet , um die Bacillus – Arten definieren. Ein einzigartiges Merkmal der Gattung Bacillus ist die Fülle an verzweigtkettigen FAs enthält 12-17 Kohlenstoffe 10-12 mit dem Verhältnis zwischen iso und anteiso Isomere ein wichtiger Faktor für die Anpassung an Umweltbedingungen zu sein. Bacillus species anzupassen auch gegenüber Umweltschwankungen , indem der Anteil an ungesättigten Fettsäuren zu verändern. In einigen Arten, wie Bacillus cereus, zwei Fettsäure-Desaturasen schaffen Doppelbindungen in unterschiedlichen Positionen der Alkylkette 13 mit unterschiedlichen Rollen in Anpassung 9. Das Beispiel des Bacillus genus veranschaulicht die Bedeutung der eben die Doppelbindung Position zu identifizieren und FA Verzweigung. Sammelnhungsweise, hat Identifizierung von Bacillus FA Muster mehrere nützliche Anwendungen. Hier schlagen wir eine neue GC-MS – Ansatz für Bacillus FA Mustererkennung, die die inhärenten Grenzen eines klassischen GC-MS – Analyse überwindet.
Dieser innovative Ansatz kann direkt auf rohen biologischen Material verwendet werden, und besteht aus einer Kombination von bestehenden Techniken: Informationen über die Retentionszeiten (ECL) und Massenspektren verschiedener FAs Derivate (FAME, DMOX und Picolinyl-Ester).
Wir verwenden die folgende FA-Nomenklatur. i, a und n iso anzuzeigen, verzweigten anteiso Methyl und geradkettige Fettsäure, respectively. Ungesättigte FAs wurden durch C genannt: d, wobei C die Zahl der Kohlenstoffatome in der Fettsäure ist und d die Anzahl der Doppelbindungen ist. Δ x gibt die Position der Doppelbindung, wobei die Doppelbindung auf der x – ten Kohlenstoff-Kohlenstoff – Bindung befindet, von der Carbonsäure Ende zählen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die FAs Chromatogrammprofile in Tabelle 1 dargestellten entsprechen B. cereus ATCC 14579 auf einer Agarplatte Oberfläche gewachsen. Ähnliche Profile wurden erhalten , wenn das Bakterium in belüfteten flüssigen Medien bei der gleichen Temperatur 8 gezüchtet wurde. Im Falle von in flüssigen Medien gezüchtet Bakterien, die bakterielle Biomasse durch Zentrifugation von dem Wachstumsmedium gesammelt und kann nach zuvor beschriebenen Protokollen gewaschen werden je nach Wachstumsbed…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind dankbar, dass Thomas Mison für seine technische Unterstützung und Rachel Kopec für das Manuskript zu revidieren.
Materials
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m x 0.25mm x 0.25µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
References
- Christie, W. W., Han, X. . Lipid Analysis 4th Edition. , (2010).
- HÜbschmann, H. -. J. . Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography – Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives – A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J., Christie, W. W. . Advances in lipid methodology. Volume 1. , 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -. H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P., Berkeley, R. C. W. . Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. , 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus – example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
