Estudar processos dinâmicos de Nano porte Objects no líquido utilizando a Transmissão Microscopia Eletrônica de Varredura

Figura 2: Procedimento de limpeza dos Microchips Si. (A) em duas provetas são preenchidos com 40-60 ml de acetona e etanol cada. Microchips (B) O Si são colocados no recipiente cheio com acetona. O lado com a membrana SiN deve estar voltado para cima. A reflexão dos dois microchips Si mostra claramente a ranhura na parte de trás de dois microchips. (C) Depois de 2 minutos, as micropastilhas de Si são transferidos para o segundo recipiente enchido com etanol. Após mais 2 min, as micropastilhas de Si são transferidos para uma sala limpa de tecido para a secagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Líquido Fluxo de Eletrônica de Transmissão Microscopy (TEM) Equipamento Holder. (A) O titular TEM fluxo de líquido com tubos de plástico e uma seringa para o fluxo de líquido. (B) A ponta do suporte TEM fluxo do líquido retirado do eixo do suporte, a tampa do compartimento do líquido celular, anéis de vedação, e duas microchips de silício. A tubagem projecta a partir do lado esquerdo da ponta. (C) O compartimento da célula líquido que mostra um anel de vedação, a ranhura para a colocação do microchip. (D) Diferentes pinças em uma superfície livre de poeira (folha de alumínio). (E) A tampa do compartimento da célula líquido com os seus dois anéis de vedação. (F) Dois microchips de silício com janelas de membrana pecado. Esquerda: o microchip amostra sem um espaçador; direita: o microchip tampa com um 200 um espaçador. (G) Um sistema de bomba de microfluidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figuré. 1. Preparação da Microchips 1. Limpeza dos microchips Prepare um espaço de trabalho com um baixo nível de poeira em uma capa laminar fluxo de ar com um filtro de partículas de poeira. Limpar uma lâmina de microscopia de vidro claro com um tecido livre de fibras e etanol puro para a colocação e transporte dos microchips. Colocar a lâmina de vidro sobre um tecido de sala limpa numa placa de Petri. NOTA: Evite a utilização de etanol técnica em todos os momentos. Selecione 5 microchips Base (sem um espaçador) para a colocação de amostra e 5 microchips com um espaçador 200 nm de espessura. NOTA: As dimensões da janela são de 20 x 400 mm 2 e a espessura pecado é 50 nm. Uma vez que existe uma certa tolerância nas dimensões, é recomendado verificar as dimensões utilizando um microscópio de luz. Use pinças revestidas de carbono para remover os microchips da caixa de armazenamento e colocá-las sobre a lâmina de vidro. Pegue os microchips com firmeza, mas com cuidado em seu lolados GN. Lidar com o microchip de tal forma que o lado da membrana do pecado é sempre virado para cima. NOTA: Evite tocar a membrana SiN frágil no lado superior. Também deve ter cuidado com a manipulação dos microchips para evitar rachaduras suas bordas afiadas, que podem causar problemas devido a partículas de silício que residem no microchip ou fugas posteriores. NOTA: treinamento para o procedimento para remover os microchips da superfície pegajosa pode ser realizado em (barato) microchips fictícios. Colocar os microchips para uma sala limpa de tecidos em uma caixa de Petri. Feche o prato e transferi-lo para o exaustor. NOTA: Os passos que envolvem a acetona são realizadas em um exaustor para a segurança química. Pegue dois copos de vidro de 120 ml. Lavar uma proveta com acetona e o outro com etanol para limpá-los. Encher o primeiro com 40-60 ml de acetona e a outra com 40-60 mL de etanol. NOTA: É importante o uso de líquidos HPLC-grade também para esta etapa no protocolo. Transferiros microchips para o copo com acetona de modo a remover o protector resistir camada. Mova cuidadosamente o copo com a mão para lavar eficazmente os microchips, mas tenha cuidado para não transformar os microchips de cabeça para baixo – veja a Figura 2. Após 2 min, remover os microchips e transferi-los rapidamente para a taça com o etanol. Mova cuidadosamente o copo à mão com etanol por 2 min para remover qualquer resíduo da camada de resistir. Cobrir o copo com folha de alumínio e transferi-lo para o ambiente de trabalho fluxo de ar laminar. NOTA: Não deixe que os microchips secar durante a transferência para evitar a deposição de detritos. Retire os microchips do copo e coloque-os em um novo tecido sala limpa. Deixe-os secar durante alguns minutos e transferir os microchips sobre a lâmina de vidro de microscópio de luz na placa de Petri. NOTA: Os microchips molhadas podem facilmente virar em torno, virar de cabeça para baixo, ou ficar com as pinças ao ser libertado. Isto pode ser evitado por prescantar os microchips suavemente sobre o papel de filtro e puxando as pinças de distância na direção horizontal. Fechar a placa de Petri e transferir os microchips para o aspirador de plasma. Colocar a lâmina de vidro com os microchips para dentro do aspirador de plasma. Executar um programa de limpeza 5 min a tornar a superfície da membrana hidrofílica e nitreto de silício para remover hidrocarbonetos. Nota: Os ajustes adequados aplicados para o nosso aspirador de plasma são: 70 mTorr, o fluxo de gás de 11,5 sccm de O2 e 35,0 sccm para Ar, alvo de 50 W para a frente de radiofrequência (RF), 5 W área RF, max refletido RF. Qualquer plasma capaz de induzir uma carga de superfície é adequado. Colocar a lâmina de vidro com o microchip de volta para a placa de Petri, fechar a tampa, e transferi-lo para o microscópio de luz. Examine os microchips sob um microscópio de luz para possíveis rupturas de membranas ou restantes partículas de sujeira. Tome especial cuidado com as áreas de janela e verificar se há pequenas manchas, indicando arupture da membrana. Dispensar microchips com membranas danificadas. Feche a caixa de Petri e armazená-lo no ambiente de trabalho fluxo de ar laminar. 2. Preparação da amostra sobre os microchips Preparar uma solução aquosa AUNP (citrato estabilizado) através da mistura de pequenas quantidades de soluções de reserva contendo 30 nm de diâmetro, AuNPs estabilizado com citrato numa concentração de ~ 3 M. Coloque os microchips em uma superfície limpa e pegajoso em uma caixa de transporte para a deposição de gotículas application / amostra. Coloque uma gota (1-2 mL) da solução de amostra no lado da membrana o pecado do microchip limpa-plasma fresco (usar um microchip sem espaçador) e deixar a solução seca na bancada fluxo de ar laminar. NOTA: Este procedimento pode ser repetido de modo a aumentar a concentração de AuNPs na membrana SiN. Aplicar 1 mL de água desionizada para o microchip para a remoção de sal e / ou agentes tensioactivos. Após 30 s, cuidadosamenteremover a gotícula de água com papel de filtro. Deixe os microchips secar ao ar no ambiente de trabalho fluxo de ar laminar. NOTA: Um número suficientemente grande de AuNPs terão aderido ao microchip e não serão lavados em água mais. Use os microchips de amostras preparadas dentro de 4 h, como o pecado perde suas propriedades de superfície hidrófila ao longo do tempo, o que pode fazer com que o líquido se comportar de forma diferente durante um experimento. Nota: Consulte a seção de discussão para mais detalhes. Use uma caixa de transporte fechado para o armazenamento e transferência dos microchips. 2. Preparação do Titular Líquido Fluxo TEM Limpeza do porta TEM o fluxo de líquido Limpe todas as ferramentas (pinças e uma chave de fenda) que estarão em contacto com peças de vácuo, utilizando acetona e etanol num banho de ultra-sons e colocá-los na superfície livre de poeira fornecido por um pedaço de nova folha de alumínio colocados na bancada de trabalho. Trabalho com luvasa evitar a contaminação do suporte TEM fluxo do líquido. NOTA: As ferramentas não tem que ser extensivamente limpos, se é certo que eles estão limpos para o trabalho com peças de vácuo. As luvas podem ser evitados se uma é capaz de lidar com o equipamento sem tocar nas peças de vácuo. Coloque o suporte TEM fluxo do líquido sob a luz do microscópio binocular de tal maneira que a ponta do suporte contendo a câmara de líquido pode ser observada. Veja a Figura 3. Remover a tampa da ponta do suporte e colocá-lo sobre a superfície livre de poeiras. NOTA: A tampa de titânio é sensível a riscos causados ​​por materiais mais duros, como as pinças. Recomenda-se usar uma pinça revestidos com polímero para materiais sensíveis. Preparar pelo menos 1-2 mL de água pura (grau HPLC). NOTA: Se não se utilizar o líquido HPLC-grade, em seguida, recomenda-se verificar se os líquidos utilizados não contêm micro partículas que poderia levar a obstruções do sistema de fluxo; filter a quantidade de água necessária com um filtro de micro-poro. Usar uma seringa de vidro (1 ml) para lavar o sistema de fluxo de todo com 0,5 ml de água pura. Recomenda-se a utilização de um sistema de bomba de seringa microfluídico. Usar uma pipeta e / ou papel de filtro para remover o líquido a ser ejectado no compartimento da célula o líquido. Teste toda a tubulação para o fluxo de líquido. Seca-se a ponta de suporte depois utilizando papel de filtro e / ou uma pipeta. Use a luz do microscópio para verificar se a ponta do titular está limpo e seco. Se necessário, lava-se a ponta do suporte com água ou com etanol para remover quaisquer resíduos sólidos que poderiam ter sido deixadas para trás pela solução seca. Remover pedaços de poeira ou restos de fibras também. Remova cuidadosamente estas peças com uma pinça, evitando assim arranhões na superfície de titânio. Além disso, verifique no interior das ranhuras de O-ring e remover os restos de líquido com um pequeno pedaço de tecido sala limpa. NOTA: Se o titular não se torne limpo com este procedimento, em seguida, recomenda-separa remover a ponta do suporte e limpá-lo em acetona durante 2 min e em etanol durante mais 2 min, utilizando um banho de ultra-sons. Inspecione todas as outras partes da ponta (O-rings, tampa e parafusos), sob o microscópio de luz e remover o pó, fibras, etc … NOTA: Ocasionalmente, pequenos pedaços provenientes dos parafusos ou as micropastilhas de Si deve ser removido tão bem. Se necessário, limpar as partes brevemente a vácuo com etanol de grau HPLC. A tampa e os parafusos podem ser limpos com ultra-som, como explicado pela dica. Evite colocar os anéis de vedação com frequência em etanol, uma vez que pode fazer os anéis de vedação quebradiços ao longo do tempo, diminuindo a sua tensão vácuo. O sistema é operado sem graxa de vácuo, mas se ocorrerem problemas de vedação, graxa de vácuo pode ser usado. Reinserir os anéis de vedação nas respectivas ranhuras do suporte e verificar se eles se encaixam e não se projetam em qualquer lado da ranhura. Mantenha titular TEM o fluxo de líquido livre de poeira até que o carregamento da amostra (por exemplo,., Cobrindo-o com uma folha de alumínio). Montagem titular TEM o fluxo de líquido NOTA: O procedimento a seguir descreve o procedimento de carregamento de microchips em um suporte de amostra com orientação ideal para STEM. Nesta configuração, o microchip base com a amostra será o microchip superior uma vez transferido para o microscópio. Veja a Figura 4. Para MET, a mais alta resolução espacial é obtido na parte inferior da célula de líquido em relação a um feixe de electrões para baixo-itinerante. Assim, os microchips seria montado o contrário. Use pinças curvas para agarrar o microchip amostra no lado longo e colocá-la no interior da ranhura (bolso) na ponta do suporte TEM fluxo do líquido. Mantenha o lado de SiN virada para cima. Verifique a colocação correta do microchip na ranhura utilizando um microscópio óptico binocular. NOTA: Se o O-ring abaixo do microchip não é colocado corretamente, o microchip pode sobressair fROM O slot. Coloque uma gota de 0,3 mL do líquido filtrado para a experiência sobre o microchip amostra utilizando uma micropipeta. Se necessário, corrigir o microchip no lugar com uma pinça, como as forças capilares da gota pode puxar o microchip para fora do seu bolso. Use uma pinça de cabeça para baixo curvas para tirar a segunda microchip (aquele com a camada de espaçador). Vire com cuidado o microchip de cabeça para baixo. Coloque o microchip espaçador no microchip de base na ranhura. NOTA: Este procedimento precisa ser feito de forma suficientemente rápida para evitar a secagem da gotícula na microchip amostra. Inspecione o posicionamento correto usando um microscópio de luz binocular enquanto se move um pedaço de material de reflexão de luz abaixo da ponta do suporte da amostra. Ambos os microchips devem estar alinhados exatamente paralela para conseguir a melhor sobreposição das janelas pecado. NOTA: No caso das janelas não se sobreponham, os microchips podem ser reposicionados, empurrando de um lado com uma ponta dea pinça, mas evitar mover os microchips muito, como a membrana SiN podem ser facilmente danificados. Alguns microchips possuem uma configuração cruzada (a janela de um microchip é perpendicular à janela na outra microchip); esta configuração facilita o alinhamento das duas micropastilhas ainda também reduz o campo de visão no microscópio electrónico. Pegue a parte da frente da tampa da câmara de amostra com a pinça e transformá-lo de cabeça para baixo. Sem tocar os microchips, coloque o lado traseiro da tampa na ponta. Lentamente abrir a pinça de tal modo que a tampa repousa unicamente sobre o ramo inferior da pinça. Cuidadosamente abaixe a tampa até que repousa sobre os dois microchips. Retire as pinças. Verifique novamente o alinhamento das janelas de ambos os microchips. Se necessário, remover a tampa, ajustar o posicionamento das micropastilhas, e posicionar a tampa novamente. Coloque os parafusos e corrigi-los em seus lugares habituais. Verificar o alinhamento das duas janelas. Euf necessário, remover os parafusos novamente e ajustar os microchips. NOTA: Não fixar os parafusos com muita força, pois isso pode causar danos. Um selo de vácuo é conseguido quando os parafusos de apertar apenas. Verifique a selagem por iniciar um fluxo de líquido através do sistema usando uma taxa de fluxo de 4 mL / min. Se há vazamento é observada em ambos os lados da ponta, isto é uma boa indicação da tensão vácuo. Transferir o titular da estação de bomba de vácuo e verificar o aperto de vácuo. O nível de vácuo deve atingir pelo menos 10 -5 mbar dentro de 5 min de bombeamento. NOTA: Recomenda-se testar a estação de bomba com um suporte de manequim antes do uso. Transferir o titular ao microscópio eletrônico, em seu gabinete para impedir que ele a ganhar pó. NOTA: Cada detentor comercial vem com um gabinete. 3. caule de um espécime em líquido Ajustar o microscópio eletrônico para STEM </strong> NOTA: A operação do microscópio eletrônico descrito neste protocolo é baseado em procedimentos padrão que podem ser encontrados no manual do usuário. O protocolo descreve o detalhe exigido para além dos procedimentos padrão para aquisição de dados em amostras líquidas. Inicie o microscópio com STEM modo alinhado. No suporte da amostra, insira uma amostra de teste consiste de um filme de carbono fino com AuNPs. Ajuste as configurações do microscópio STEM da seguinte forma: definir a corrente de sonda para 0,18 nA ea convergência semi-ângulo do feixe de elétrons para 20 mrad, selecionando um tamanho de ponto de 4C e a abertura objectivo de 30 mm. Selecione um comprimento câmera de 8 cm. Anote a densidade de corrente indicada medido na tela de fluorescência, enquanto o detector ADF está inserido. Remover o suporte da amostra. NOTA: Este valor actual é necessário mais tarde, para estimar a espessura do líquido. Iniciar o fluxo de líquido com água pura. Não exceda um fluxo de 2mL / min. Insira o suporte TEM fluxo do líquido no microscópio eletrônico e começar a evacuação. Verifique tanto a indicação de vácuo da câmara de pré-vácuo e a duração da evacuação. Se o nível de vácuo é padrão e a duração do processo de bombagem não exceda o tempo normal de evacuação (de cerca de 1 min) por um factor de dois, inserir o suporte. Abrir a válvula de feixe quando o vácuo da câmara de amostra principal está na gama que permite a sua abertura. Insira o detector ADF premindo o botão ADF. NOTA: Este protocolo refere-se a um detector ADF posicionada acima da tela de fósforo do microscópio eletrônico. Defina o microscópio no modo de aquisição de imagem contínua usando um tamanho de imagem de 512 x 512 pixels, um tempo de pixel de permanência de 2 mS, e uma ampliação de 20.000. Procurar a janela de SiN, traduzindo o estágio no direções x e y. NOTA: Os microchips bloquear quaisquer elétrons que passam através da amostra para a detecçãoou; sinal só é visível no local do pecado. Veja a Figura 5. Às vezes, é mais fácil encontrar a janela de SiN, visualizando a tela de fluorescência. Uma vez que a janela foi encontrado, ajustar as configurações de contraste e brilho (utilizando os respectivos botões) para que a borda da janela torna-se visível. Mover a borda para o centro do campo de vista, premindo os botões de X e Y de tradução da fase da amostra. Pressione o botão de reset da lente objetiva. NOTA: O brilho deve ser largamente reduzido em comparação com uma amostra de vácuo em virtude da forte dispersão no líquido. Proceder por grosso focar a curva fechada na borda da janela do SiN, ajustando a posição vertical (z-translation) da fase de amostra. Verifique se a posição da amostra está na altura eucentric rodando o palco por 5 ° e rodando-a de volta. Características da amostra e no canto da janela do pecado não deve mudar em baixas ampliações. <br/> NOTA: fechar a válvula de feixe não se trabalhar com o microscópio, uma vez que a digitalização na mesma posição por um tempo mais longo pode resultar em danos amostra e a formação de bolhas Reajustar a posição vertical, conforme necessário para colocar a borda da janela no meio da área de visualização novamente. Guardar a posição do estágio utilizando o botão de armazenamento do software. Mover-se para uma posição em que pequenos pedaços de detritos ou outros objetos de alto contraste (por exemplo, AuNPs) estão presentes, traduzindo o estágio no direções x e y. Ajuste o foco da lente objetiva, para que todos os objetos aparecem nítidas no foco. Adicione nota de a densidade de corrente medida na tela de fósforo visível através do software de funcionamento, indicando o corrente transmitida através do suporte líquido e através da abertura do detector de AAD. Calcula-se a espessura da célula de líquido usando a Equação 1. Prosseguir apenas se o líquido espessura foi determinada e não excede 3 um. <br /> NOTA: A espessura da célula de líquido pode ser determinada pela razão da densidade de corrente medido com e sem a amostra utilizando a seguinte equação 14 equação 1 com t Sin a espessura da membrana de nitreto de silício amorfo e água t a espessura da camada de água. O percurso livre médio comprimentos montante a l SiN = 0,79 mm do pecado, e = l de água = 3,0 mm de água para o detector de abertura semi-ângulo de 35 mrad 14. Observar cuidadosamente o líquido nas ampliações menores para garantir que as bolhas de gás não estão presentes. As bolhas de gás pode ser evitada por utilização do fluxo de líquido contínua e sonda de corrente inferior a 5 0. Na. Traduzir o estágio nas direções X e Y até uma área que contém pelo menos 20 AuNPs has foi encontrado. Defina o tamanho da imagem para 1.024 x 1.024 pixels, o tempo de permanência de pixels a 19 mS, e a ampliação para 400.000. Adquirir imagens de AuNPs aderidas à membrana SiN, premindo o botão de aquisição. NOTA: Uma vez que as imagens tenham sido obtidos em que os AuNPs são visíveis com um forte contraste e arestas (veja a Figura 6), pode-se ter certeza de que o experimento está configurado corretamente. No caso de problemas inesperados ocorrem, não prossiga com a experiência, mas certifique-se de resolver a causa. STEM da dissolução da AuNPs Retirar o suporte TEM fluxo do líquido a partir do microscópio e parar o fluxo de líquido. Preparar pelo menos 1 mL de uma solução de 0,1 M de cloreto de sódio em água de grau HPLC numa seringa de vidro. Ajustar o sistema de fluxo a uma velocidade de 20 mL / min e lave o sistema de fluxo de todo com 0,3 mL da solução salina. Use papel de filtro para recolher o líquido a ser ejectado naoutra extremidade do tubo. Em seguida, re-ajustar o sistema de fluxo de 2 mL / min. Verifique a integridade da janela do SiN usando um microscópio de luz binocular. Se nenhuma fuga for observado, reinserir titular TEM fluxo do líquido para dentro do microscópio. Verifique a indicação do vácuo da câmara de pré-vácuo e a duração da evacuação. Se o nível de vácuo é padrão e a duração do processo de bombagem não exceda o tempo normal de evacuação (de cerca de 1 min) por um factor de dois, inserir o titular Coloque a parte posterior estágio do microscópio de volta à sua posição anterior, utilizando a posição estágio armazenado. Defina o microscópio no modo de aquisição de imagem contínua usando um tamanho de imagem de 512 x 512 pixels, um tempo de pixel de permanência de 2 mS, e uma ampliação de 20,000X. Ajustar o contraste, brilho, foco e altura eucentric, conforme descrito nos passos 3.1.7-3.1.9. Encontre um local de interesse, traduzindo o estágio no direções x e y. Defina o tamanho da imagem1.024 x 1.024 pixels, o tempo de permanência do pixel a 2 microsiemens e a ampliação para 500.000. Gravar uma série de imagens STEM manualmente pressionando o botão de aquisição uma vez que a imagem anterior foi registrada. NOTA: As AuNPs começar a dissolver-se assim que o feixe de electrões é digitalizado através da amostra. As partículas fora da área irradiada não é afectado e pode ser observado imediatamente após. O carimbo de tempo é armazenado no cabeçalho da imagem. É também possível usar um software automatizado para a recolha de uma série de imagens em um filme. A desmontagem e limpeza do suporte de MET após o experimento Quando as experiências de MET em fase líquida são concluídos e o detentor é retraído do microscópio electrónico, limpar o tubo, a câmara de líquido, e seus componentes, a fim de remover quaisquer partículas sólidas ou sal restante que podem influenciar experiências futuras. Solte o parafuso de trás um pouco para que ele ainda é fixona respectiva ranhura mas a tampa pode ser facilmente removida. Solte o parafuso da frente, removê-lo e colocá-lo em um ambiente livre de poeira. Remover a tampa e colocá-lo em ambiente isento de poeira para o armazenamento. Remova os dois microchips do bolso. Separá-los mergulhando-as cuidadosamente em água ou na solução remanescente da experiência. Coloque os microchips sobre papel com o lado da membrana do SIN para cima e deixe-os secar ao ar para análise posterior. Remova os anéis de vedação e limpar as respectivas ranhuras com água de grau HPLC. Armazenar os anéis de vedação em um ambiente livre de poeira. Usar uma seringa de vidro (5 mL) para lavar todos os tubos (entrada e saída), cada um com 5 mL de água de grau HPLC. Recolhe-se o líquido com um pequeno copo colocado debaixo da ponta do suporte MET. Após a lavagem, utilizar uma pipeta e / ou papel de filtro para remover o líquido restante a partir do compartimento de líquido. Inspecione a ponta do porta-TEM e remover resíduos como bordas quebradas do micro siliconebatatas fritas, fibras ou pó. Se o sal é ainda visível, repita o procedimento de limpeza. Devolver os anéis de vedação para os seus sulcos. Armazenar o suporte do TEM e seus componentes em um ambiente livre de poeira. Alternativa procedimento para 3.2: STEM de mover nanopartículas de ouro NOTA: Um procedimento de montagem diferente é necessária para estudar o movimento de AuNPs em líquido. Omitir o passo 1.2. Coloque os AuNPs sobre o microchip de silício imediatamente antes de inseri-los no Suporte TEM no passo 2.2. Manter a amostra coberta por uma camada de líquido em todos os momentos, a fim de evitar uma forte ligação das AuNPs para a membrana SiN. Os outros passos do protocolo são os mesmos. Uma série de imagens haste é obtido no passo 3.2.6. Figura 4: Montagem do suporte líquido Fluxo TEM. (A) O compartimento da célula líquido com the menor O-ring colocado na respectiva ranhura. A inserção mostra a vista superior. (B) O microchip de base é colocado no respectivo encaixe. A inserção mostra a vista lateral em tal ângulo que o microchip é visível de reflexão da luz. (CD) Uma gota da solução é adicionada ao microchip. (EG) A colocação do microchip tampa. (HI) Colocação da tampa do compartimento da célula do líquido. (J) de fixação da tampa, com os dois parafusos. (K) montado titular TEM fluxo de líquido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Posicionamento inicial e Focando usando micrografias STEM. (A) Para localizar a janela SiN, o palco é movido para o sig mais brilhantenal. O microchip de silício é fina o suficiente para alguns elétrons de passar por perto da janela. (B) A borda da janela SiN focado mostrando algumas AuNPs aparecem brilhantes na janela de membrana SiN escuro (menos de espalhamento). A borda do microchip é clara, devido ao espalhamento excessivo. (C) A focagem é feito no canto da janela do pecado. As imagens mostram sub-focalizado, em foco, e situações de sobre-foco. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.