Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid
Summary
Vi presentiamo un metodo per ottenere immagini a risoluzione sub-nanometrica con (modalità tapping) modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in un liquido. Il metodo è dimostrata su microscopi commerciali a forza atomica. Spieghiamo la logica alla base delle nostre scelte di parametri e di suggerire strategie per l'ottimizzazione risoluzione.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user’s specific system.
Introduction
Fin dalla sua invenzione, tre decenni fa, microscopia a forza atomica (AFM) 1 si è affermata come una tecnica di scelta per indagare campioni su scala nanometrica, specialmente dove una media di oltre superfici macroscopiche non è possibile ed è necessario informazioni locali. In una misurazione tipica AFM, la deviazione di un cantilever flessibile viene usato per quantificare la forza di interazione tra un piccolo numero di molecole e una punta ultrasharp montato all'estremità del cantilever. A seconda del tipo di interazioni ed i tempi considerati, una vasta gamma di informazioni possono essere derivate, incluse le proprietà viscoelastiche delle membrane biologiche molli 2,3, la forza di un singolo agente chimico o legame molecolare 4,5, i dettagli atomistici di un superficie di 6-8, la magnetica 9, capacitivo 10, lo svolgimento di 11, termiche e chimiche 12,13 14 immobili di campioni <sup> 15. Parte del successo della AFM è la sua capacità di lavorare su una vasta gamma di materiali 16 e in molteplici ambienti come vuoto 17, gas o liquidi 11,18 19,20, perché non si basa su una forza specifica tra la sonda e il campione .
In pratica, tuttavia, il funzionamento del AFM in condizioni diverse ambientale può essere difficile e molti risultati pubblicati sono ancora ottenuti in aria. Un'ulteriore difficoltà deriva dal fatto che è di solito necessario azionare il AFM in modalità dinamica (punta vibrante) al fine di preservare sia punta e del campione, evitando grandi forze di attrito. Anche se più impegnativo, il funzionamento dinamico può in linea di principio di fornire ulteriori informazioni sul campione analizzato, e senza perdita di risoluzione spaziale. Negli ultimi dieci anni, il campo di AFM dinamica nel liquido ha visto importanti sviluppi, dal avvento del video-rate AFM 21 – 23, a misure multifrequenza <sup> 24,25 e sub-nanometrica di imaging delle strutture di idratazione alle interfacce 26 – 31. Operazione AFM mentre immerso nel liquido viene ora utilizzato di routine in biologia e biofisica 32-36, la ricerca polimerica 37, elettrochimica 38-40 e solido-liquido interfacce caratterizzazione 41-44. La presenza di liquido attorno al cantilever vibrante altera considerevolmente la sua dinamica 45 nonché l'interazione tra la punta e il campione 29,42. Se usato in modo appropriato, il liquido può essere sfruttata per migliorare la risoluzione delle immagini 26,29, con un tipico miglioramento di quasi un ordine di grandezza rispetto ai migliori risoluzione ottenuta in condizioni ambientali 46.
In AFM, la più alta risoluzione spaziale ottenibile per una particolare misura dipende sia la qualità del AFM stessa e la natura di tha sondato l'interazione 20,47,48. Attualmente, la maggior parte di fascia alta, AFMs disponibili in commercio presentano livelli di rumore che sono vicino a quello del limite termico 12 in modo che il fattore determinante per la risoluzione è di solito l'interazione punta-campione. E 'efficace il gradiente spaziale di questa interazione che determina la risoluzione: misurazioni basate su corto raggio, in rapida decomposizione interazione producono risultati risoluzione superiore a quella in cui le interazioni a lungo raggio sono in gioco. Nel liquido, forze solvatazione possono migliorare la risoluzione delle immagini perché tendono a scomparire sopra solo pochi diametri molecolari del liquido (tipicamente <1 nm) quando si allontana dalla superficie del campione 49. Queste forze hanno origine dall'interazione tra le molecole del liquido e la superficie del campione. Un liquido con una forte affinità per la superficie tenderà ad essere più ordinata e meno mobile liquida massa all'interfaccia con il campione 29,42,50. Di conseguenza,ci vorrà più energia per una punta AFM vibrante per spostare molecole liquide di interfaccia di rinfuse liquide 42, rendendo la misura molto sensibile a variazioni locali nelle proprietà del liquido di interfaccia su nanoscala -la solvatazione paesaggio.
Per sfruttare forze solvatazione, alcuni aspetti pratici devono essere presi in considerazione. Innanzitutto, l'ampiezza di oscillazione della punta deve essere paragonabile alla gamma delle forze di solvatazione, tipicamente <1 nm. In secondo luogo, il liquido usato deve formare un paesaggio solvatazione ben definita sulla superficie del campione. Macroscopico, ciò equivale a richiedere un liquido 'bagnante' per il campione in esame. Ad esempio, in acqua è più facile ottenere una risoluzione a livello molecolare su mica idrofila che idrofobica sul 42,51 grafite. Infine, la costante elastica del cantilever sostenere la punta deve essere scelta opportunamente 52,53. Quando si lavora in questi concondizioni, l'AFM non solo fornisce immagini a livello molecolare dell'interfaccia, ma deriva anche informazioni riguardo l'affinità campione di liquido locale, che può essere utilizzato per ottenere informazioni chimiche sulla superficie del campione 54.
I modi più comuni dinamiche di funzionamento per AFM in liquido sono modulazione di ampiezza (AM, anche 'modalità tapping') AFM e la frequenza di modulazione (FM) AFM. Nel primo caso 55, la punta raster-scansione del campione mentre la sua ampiezza di vibrazione è mantenuta costante da un anello di retroazione che continuamente ri-regola la distanza punta-campione. Una immagine topografica del campione è ottenuta dalla correzione applicato dal circuito di retroazione. In FM-AFM 28,41,56, è la frequenza di oscillazione del cantilever / punta che viene mantenuta costante mentre la punta scansiona il campione. Entrambe le tecniche offrono una risoluzione topografica paragonabile a liquido 36,57. La quantificazione della interazione punta-campione tende ad essere più straightforward e preciso in FM-AFM, ma AM-AFM è più facile da implementare, più robusto, e permette di lavorare con cantilever morbidi, qualcosa di utile per studiare i campioni facilmente deformabili o delicati. Significativamente, AM-AFM è più diffusa tra gli utenti AFM, in parte per ragioni storiche, ma anche a causa del fatto che è tecnicamente più facile da controllare.
Sebbene l'ampiezza è mantenuta costante dal circuito di retroazione durante l'imaging AM-AFM, la fase che intercorre tra l'oscillazione punta e l'oscillazione di guida è permesso di modificare liberamente. La fase-lag può fornire informazioni utili sulle interazioni punta-campione, essendo legata all'energia dissipata durante l'oscillazione della punta all'interfaccia con il campione 58. Quindi fase di immagini può essere acquisita contemporaneamente all'imaging topografica, ed è spesso complementari in evidenza l'eterogeneità di una superficie del campione. Imaging fase è stata utilizzata per vari mappatura delle interazioni, compresa la dimappatura rect di energia adesione 42, proprietà viscoelastiche 58 e il paesaggio idratazione di un'interfaccia 44.
Praticamente, ottenendo immagini ad alta risoluzione in liquido rimane non banale a causa del gran numero di parametri da controllare, e l'assenza di un semplice protocollo sistematico che funziona in ogni situazione. La qualità dell'immagine dipende tipicamente dalla geometria a sbalzo e l'elasticità, la chimica punta, l'ampiezza di oscillazione, e la rigidità di esempio, tra gli altri 55. misure AFM sono, per definizione, perturbativi al sistema. Come risultato, cambiare le variabili di imaging e condizioni ambientali senza considerazioni proprie può portare a difficoltà di riproducibilità e / o osservazioni misrepresentative ea falsi risultati.
Qui, vi presentiamo il nostro protocollo per ottenere immagini ad alta risoluzione di campioni duri e molli in soluzione, utilizzando strumenti commerciali gestite in amplitude-modulazione. Il nostro obiettivo è quello di offrire una procedura pratica per ottimizzare i principali parametri che possono influenzare la risoluzione su diversi campioni, spiegando in ogni caso le motivazioni per le nostre scelte dai principi fisici alla base del processo di imaging. Noi dettaglio un approccio step-by-step, dalla pulizia del substrato e preparazione, a scelta del cantilever, regolazione dei parametri di imaging e di risoluzione dei problemi comuni. Spiegando la logica scientifica dietro le nostre scelte e le procedure per alta risoluzione dovrebbe aiutare fare scelte razionali quando adattare la metodologia, e servire come punto di partenza per i sistemi di imaging nuovi.
In tutto questo testo usiamo AM per fare riferimento al modo di funzionamento di modulazione di ampiezza di un AFM. Ci riferiamo al parametro di retroazione mantenuta costante sia durante la deflessione a sbalzo (modalità contatto) o ampiezza di oscillazione (modalità AM) al valore di riferimento. In modalità AM, il cantilever è guidato dall'esternomediante un'oscillazione acustica o da un laser pulsato focalizzata alla base del cantilever. L'ampiezza azionamento è l'intensità del segnale oscillatorio esterna. Il valore assoluto dell'ampiezza motrice necessaria per ottenere una data ampiezza di oscillazione del cantilever dipende da molti parametri come il metodo di azionamento (acustica, fototermico o magneticamente), fissazione cantilever e parametri (rigidità, geometria) e l'allineamento laser. L'esatto valore dell'ampiezza unità non è pertinente ma è regolata in ogni esperimento in modo da fornire un adeguato (e quantificabile) ampiezza di oscillazione del cantilever. Quando il cantilever guidato è lontano dal campione e senza smorzamento della sua vibrazione avviene attraverso interazioni punta-campione, la sua ampiezza di oscillazione è detta ampiezza di oscillazione libera. Come la punta vibrante avvicina alla superficie del campione, la sua ampiezza comincia a diminuire. Se il feedback è attivata, la Z-piezo sarà constantly regolare nuovamente la sua estensione in modo che alla chiglia l'ampiezza setpoint impostato, costante. Il valore di riferimento è normalmente sempre più piccolo l'ampiezza libera. È comune per riferirsi al rapporto setpoint, il rapporto tra l'ampiezza del valore di riferimento (imaging ampiezza) sopra l'ampiezza libera. Più piccolo è il rapporto di setpoint, il più duro le condizioni di imaging sono.
Protocol
Representative Results
Discussion
Supponendo che il liquido imaging e la rigidità cantilever sono stati selezionati opportunamente, le fasi più critiche per la riuscita-alta risoluzione sono la regolazione dell'ampiezza di imaging e la pulizia generale del sistema investigato.
Ampiezze paragonabile allo spessore della regione interfacciale liquido (tipicamente inferiore a 2 nm) Sonde principalmente variazione delle proprietà del interfacciale solvente 42. Se l'ampiezza di oscillazione è troppo grande, la punta vibrante attraverserà a lungo raggio, campi di forza non lineari 52 che precludono la stabilità del movimento cantilever, e inevitabilmente colpito il campione indipendentemente dalle condizioni di imaging 29, con conseguente deterioramento della risoluzione. A parte la perdita di risoluzione, armoniche superiori cominciano ad apparire nel movimento punta e il sistema diventa più complicato per modellare 55. In alternativa, se l'ampiezza di imaging è troppo piccola oparte nly dell'interfaccia è sondato (tipicamente strati specifici del liquido interfacciale) e l'imaging stabile può essere raggiunto solo con cantilever rigidi (> 10 N / m in acqua 53) per un soddisfacente rapporto segnale-rumore, con il rischio di campioni morbidi dannosi su grandi variazioni di altezza. La necessità di cantilever rigide è quello di superare il rumore termico che può diventare più significativo che il segnale misurato Quando si lavora con piccole ampiezze, le interazioni a lungo raggio tra la punta e il campione sono ancora presenti, ma sono in gran parte costante e non influenzano la ad alta risoluzione di contrasto nelle immagini ottenute.
Pulizia dell'ambiente imaging è di fondamentale importanza quando si tratta di alta risoluzione AFM. composti indesiderati nel sistema possono interferire con sia l'imaging e la spettroscopia di forza. Ci sono due categorie principali di contaminazioni che tendono ad incidere esperimenti: (i) i contaminanti direttamente visibile quando l'imaging ( <strong> Figura 4B, 4C) e (ii) generale inspiegabile mancanza di alta risoluzione. Caso (i) tende a verificarsi solo in sistemi altamente idealizzate come all'interfaccia acqua-mica dove aggregati molecolari adsorbiti che interferiscono con le interazioni punta-campione sono chiaramente in contrasto contro la superficie mica atomicamente piatta (Figura 4A). Prima di sostituire la punta e il campione, vale la pena acquisire curve spettroscopiche con una grande deformazione, efficace premendo forte la punta contro il campione ripetutamente. Questo normalmente danneggiare una nuova punta, ma può di tanto in tanto pulire un suggerimento sporco o indurre siti di idratazione stabili idonei per l'imaging. Questo suggerimento, tuttavia, inevitabilmente attenuato e quindi essere adatto solo per il campione piatto, anche se la formazione immagine migliora. In caso di sospetta contaminazione su campioni rigidi, può valere la pena cercare di immagine con il secondo dei modi propri del cantilever, prima di eseguire la procedura in qualche modo distruttivo descritto sopra. Ciò richiede semplicemente swprurito la frequenza di guida per il secondo dei modi propri e riaggiustare l'ampiezza / setpoint (vedi la discussione sulla risoluzione dei problemi di seguito). La rigidità efficace degli aumenti a sbalzo considerevolmente quando operava al secondo modi propri e di qualsiasi contaminante debolmente adsorbito può essere spinto via dalla punta mentre imaging. Questa strategia non sostituisce la necessità di un campione pulito e punta, ma offre alcune ulteriori possibilità di acquisire immagini soddisfacenti quando una punta / campione non è chiaramente l'ideale.
Figura 4: Esempi di contaminazione osservata quando l'imaging mica muscovite che inibiscono l'imaging ad alta risoluzione. A: Mica ripreso in 5 mM rbcL – particelle contaminanti sono visibili. B: La contaminazione assumendo la forma di aggregati dell'ordine di decine di nanometri attraverso mentre l'imaging in acqua ultrapura nominalmente. C: strutture auto-assemblate formate da contaminazioneparticelle Nant presumibilmente anfifilici in natura. Imaging è stato nuovamente condotto in acqua ultrapura nominalmente. D: sezioni sfalsate verticalmente corrispondenti alle linee tratteggiate in A, B e C illustrano la deviazione dalla superficie atomicamente piatta di mica. Barre di scala in A, B e C corrispondono a 300 nm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Caso (ii) è più comune e caratterizzata principalmente dal fatto frustrante che le caratteristiche sub-nanometrica semplicemente non possono essere risolte, indipendentemente dalle condizioni di imaging. La firma di questo tipo di situazione è di solito visibile in misura spettroscopia di forza che tendono a mostrare alcune incongruenze. Questi possono includere le curve scarsamente riproducibile e ampiezza vs curve a distanza che si discostano significativamente da una tipica forma sigmoidale 42. Se contaminanti, ionici o di altro tipo, sono Dispersed omogeneo per tutto il fluido, non possono presentarsi nella diagnostica per immagini topografica, ma potrebbe disturbare la struttura idratazione del campione 69, che è fondamentale per il mantenimento di un normale interazione punta-campione 29 e l'ottenimento di alta risoluzione 70. Ci possono essere anche effetti diretti dei contaminanti sul campione, soprattutto in morbido, esperimenti biologici. Ad esempio, è noto che la presenza di alcoli (dalla procedura di pulizia) può fluidificare gel-fase lipidica bistrati 71 – 73, rendendo impossibile risoluzione livello sub-nanometri. Se ad alta risoluzione non è possibile, occorre prima presa nel processo di pulizia, concentrandosi in particolare su qualsiasi apparecchiatura che entra in contatto con la soluzione di imaging. composti Anche apparentemente stabili come la resina epossidica può solvato nella parte fluidi se non completamente indurito.
Imaging ad alta risoluzione con AM-AFM è esigente, richiede pazienza espesso diverse prove prima di raggiungere le migliori condizioni di imaging possibili. Piccoli problemi sperimentali possono facilmente diventare abbastanza importante per impedire ad alta risoluzione e la risoluzione dei problemi abilità sono essenziali. Qui di seguito elenchiamo alcuni dei problemi più comuni che abbiamo incontrato con la nostra soluzione proposta.
messa a punto a sbalzo
La maggior parte dei AFMs commerciali usano eccitazione acustica per guidare il cantilever. In tal caso, messa a punto del cantilever, come descritto nel passaggio 5.4, in prossimità della sua frequenza di risonanza spesso fornisce prestazioni sufficienti per il funzionamento in aria. In ambienti liquidi, il liquido tende a indurre alcuni accoppiamento tra le varie parti meccaniche del AFM come circuito integrato a sbalzo e supporto. Questo può influenzare la risonanza apparente del cantilever, spesso illustrato da uno spettro di frequenza sbalzo che presenta molti picchi taglienti e valli comunemente descritti come "foresta dei picchi". Come risultato, è spesso difficile trovare corrisponfrequenza di azionamento ct. Questi picchi esistono anche in ambienti di gas, ma a causa del valore elevato fattore di qualità del cantilever, l'ampiezza a risonanze è considerevolmente più grande 74,75. Nel liquido selezionando il picco appropriato per guidare il cantilever può non essere facile e può richiedere tentativi ed errori. In pratica, il picco di frequenza con variazione più ripida ampiezza nella "foresta dei picchi" attorno alla frequenza di risonanza è di solito la cosa migliore pur non essendo necessariamente esattamente sulla risonanza e spesso fornisce una frequenza di pilotaggio adeguata per ottenere immagini ad alta risoluzione.
la distorsione dell'immagine
Imaging deriva è spesso un problema quando si cerca ad alta risoluzione e rende le immagini appaiono distorte (tipicamente allungato). La sua origine è generalmente termico, sia perché lo scanner / AFM non ha raggiunto la temperatura di funzionamento di equilibrio, o perché parte del campione liquido evapora rapidamente (ad esempio, imaging in alcoli ). In tutti i casi, la deriva diventa trascurabile in equilibrio termico. È quindi utile per fissare la temperatura del campione, se possibile. Altrimenti, è opportuno lasciare la AFM per analizzare un campione bianco (scansione grande formato al tasso di scansione lenta) per diverse ore prima di condurre l'esperimento. Se l'evaporazione non è un problema, questa procedura è fatto meglio dopo il punto 6 della procedura, avendo cura di prima ritirare la punta a breve distanza (ad esempio, 20 micron) dalla superficie. Di tanto in tanto, la deriva rimarrà anche dopo vasta termalizzazione. Questo di solito indica che la mensola o il suo chip è in parte trascinando il campione, mentre per immagini, una cosa che può accadere su campioni coesivi molli come film sottili o se la punta / a sbalzo / chip non è opportunamente collocato. Sul chip che ospitano più di un cantilever / punta, è spesso utile per rompere il cantilever, che non sono in uso, piuttosto che lasciare che trascinano sulla superficie.
Forza ionica
S copi "> Poiché imaging è dominato dal liquido interfacciale, a volte è utile aggiungere del sale per immagini ad alta risoluzione della superficie carica in acqua. Il ruolo del sale è duplice. In primo luogo, esso modifica il paesaggio idratazione della superficie ripreso su adsorbimento, che spesso migliora il contrasto. in secondo luogo, aiuta schermo forti interazioni elettrostatiche tra la punta e del campione (ad esempio, su mica). in generale, gli ioni più grandi, potassio, rubidio e cesio consentono immagini migliori per le loro proprietà di idratazione specifiche 76, e il fatto che spesso assorbono principalmente in uno stato di idratazione unico 77.Bad sbalzo / punta
Se si sospetta che il cantilever è una fonte di contaminazione (vedi sintomi descritti in precedenza), si deve prima controllato al microscopio ottico. Se conservato in una scatola di gel, il cantilever può raccogliere tracce di polimeri gel o olio di silicone 59 che può apparire, In casi estremi, come macchie scure, sul retro del cantilever (come in Figura 5A). Photothermal oscillazione del cantilever può indurre macchie simili, ma sono dovuti alla degradazione / surriscaldamento del rivestimento sbalzo dal laser guida. La contaminazione tende a appare casualmente sul cantilever. A più lungo (12 ore) di pulizia con isopropanolo e, quindi, con acqua ultrapura può rimuovere eventuali particelle indesiderate dal cantilever.
Figura 5: Confronto tra un nuovo cantilever e uno identico che è stato ampiamente utilizzato su superfici dure e lasciato in una scatola di gel per un periodo prolungato. A: Top; immagine ottica di nuova mensola che è stato pulito (vedi procedura). Parte inferiore; ottico d'immagine che dimostra la comparsa di contaminazione visibile (freccia blu) dalla scatola del gel. B: confronto tra rispettivi spettri termica cantilever.Ampliamento del primo picco di risonanza del vecchio sbalzo è chiaro (freccia verde) e alcuni modi di ordine superiore sono migliorate (freccia blu). Spectra è stato spostato verticalmente e presentata su scala log-log per chiarezza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Se la risoluzione sub-nanometrica richiesto non viene raggiunto, nonostante immagini accettabili a risoluzione inferiore, è possibile che la punta AFM è diventato chimicamente modificato durante il suo ambiente di storage. Questo può essere trattata mediante esposizione del chip cantilever ad un ossidante ultravioletti per 120 sec, che aiuta la creazione di gruppi idrofili superficiali sulla punta 60. Si deve prestare attenzione però, come il tempo esatto necessario possono variare a seconda della geometria della punta e di potenza UV, e sovraesposizione può provocare ottundimento della punta e risoluzione ridotta.
rumore termico </ P>
Immagini ad alta risoluzione richiede grande sensibilità alle variazioni di forza e distanze (tipicamente le forze sub-PN e sub-Ångström distanze 78). Per cantilever morbidi, il moto termomeccanica del cantilever a causa della sua intrinseca moto browniano (vibrazione termica) può essere un problema. In prima approssimazione, con un cantilever di rigidezza k, non è possibile misurare le caratteristiche più piccole di quelle 
, L'ampiezza del rumore termico, dove k è la costante di Boltzmann B e T è la temperatura. In pratica, utilizzando cantilever con frequenze di risonanza più elevate diffonde il rumore in una gamma di frequenza più ampio, e riduce la rumorosità complessiva nella banda di misura 79.
l'imaging dei modi propri Superiore
A volte può essere utile per operare il cantilever in seconda dei modi propria causa della rigidità effettiva crescita (vedi la discussione di contaminazione). In pratica, questo è fatto semplicemente guidando cantilever alla seconda modi propri (il secondo picco di risonanza alla frequenza più elevata, vedere Figura 1A). Con l'adattamento del cantilever, è sufficiente selezionare il secondo dei modi propri al posto della risonanza principale e passare al punto 5.4. Si noti che i InvOLS saranno diverse quando il cantilever viene azionato nel secondo modi propri; tipicamente ~ 1/3 dei InvOLS misurati in fase 5.2 per un cantilever rettangolare.
Il limite principale di questa tecnica è che richiede un paesaggio solvatazione stabile alla superficie del campione. Il campione dovrebbe essere sufficientemente robuste per consentire perturbare il liquido interfacciale senza indurre fenomeni significativi e deformazione del campione stesso. Questo può essere difficile a molto morbido e campioni instabili così grandi biomolecole. Inoltre, piccola ampiezza AFM come descritto qui non possono ottenere informazioni sulla meccanica properties di un campione, come la punta a sbalzo trascorre la maggior parte del suo tempo nel fluido interfacciale. Per questo, può essere utile utilizzare altre vie, come Quantitative nanomeccanici Mapping 80 o fare uso di alte armoniche di movimento a sbalzo. Armoniche più alte sono generalmente migliorate quando l'imaging a fluido (con bassa qualità-fattori) 29,81 – 83 e in grado di fornire simultaneamente la topografia e la rigidità dei campioni 25,81 – 84, ma sono generalmente dannosi per alta risoluzione. Altre limitazioni inerenti a tutte le tecniche di microscopia a scansione di sonda sono ancora valide qui, in particolare il fatto che i risultati contengono inevitabilmente informazioni sulla punta di misurazione. L'uso di piccole ampiezze è anche non ideale per campioni con grandi variazioni di altezza; l'anello di retroazione inevitabilmente reagire più lentamente quando le variazioni di altezza sono più grandi l'ampiezza di imaging, quindi rischiando campione e punta danni. L'uso of morbida cantilever attenua questo problema in una certa misura.
Il principale vantaggio del metodo qui presentato è il fatto che esso fornisce la più alta risoluzione possibile con AFM in liquido, ma può essere implementata in qualsiasi AFM commerciale, a condizione che la rumorosità della macchina sono sufficientemente bassi. risoluzione paragonabile su strumenti commerciali è di solito realizzato in modalità contatto, o occasionalmente in FM-AFM con cantilever rigide. Lavorare in AM-mode e con cantilever relativamente morbide permette una scelta più ampia di campioni, ed è più facile da implementare rispetto FM-AFM sulla maggior parte dei sistemi. Questo approccio si basa sullo sfruttamento delle forze di solvatazione esistenti all'interfaccia tra qualsiasi solido e liquido per migliorare la risoluzione e ottenere informazioni chimiche locale. Si può in linea di principio essere utilizzato in condizioni ambientali, contando solo sugli strati d'acqua (tipicamente diversi spesse nanometri) costruendo sulla maggior parte delle superfici a causa dell'umidità dell'aria. I principi alla base delstrategia ad alta risoluzione restano invariati ma la maggior parte della punta è in aria, con solo un ponte capillare tra il vertice punta e il campione 85. Ad alta risoluzione è stata dimostrata su campioni rigidi in queste condizioni 86,87. Le condizioni di imaging sono comunque diverse da quelle di liquido immerso a causa di un elevato fattore Q di oscillazione del cantilever. In pratica, abbiamo trovato difficile ottenere un funzionamento stabile in campioni morbidi o irregolari, presumibilmente a causa di cambiamenti temporali del ponte capillare e incrementato Q-fattori per un dato rigidità sbalzo.
Il protocollo qui descritto offre una metodologia per ottenere immagini ad alta risoluzione a livello molecolare di campioni in un liquido con la maggior parte moderni AM-AFM commerciali. Noi forniamo la logica scientifica dietro la nostra scelta di parametri di imaging e di sottolineare il ruolo delle forze di solvatazione. Discutiamo anche problemi comuni e, in particolare, la contaminazione. Le interazioni specifiche punta-campione can variare notevolmente a seconda del contenuto della soluzione di imaging, la geometria a sbalzo e materiale, e la chimica del campione. Una comprensione pratica della natura delle forze dominanti presenti durante la scansione è quindi essenziale adattare questo protocollo per nuovi sistemi e garantire risultati affidabili. Quando ottimizzato, l'approccio sperimentale è efficace per guadagnare in-situ intuizioni livello molecolare locali di campioni in soluzione.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento previsto dal Ingegneria e Scienze Fisiche Research Council (sovvenzioni 1.452.230 e EP / M023915 / 1), Biotecnologia e Scienze Biologiche Research Council (Grant BB / M024830 / 1) e del Consiglio europeo (7 ° PQ CIG 631.186) sono ringrazia.
Materials
| Multimode IIIA AFM | Brucker | NA | One of the machine used |
| Cypher ES AFM | Asylum Resarch | NA | One of the machine used |
| AFM cantilever/tip | Nanoworld | Arrow UHF-AUD | best for high frequency |
| AFM cantilever/tip | Olympus | RC800-PSA | versatile and cheap |
| ultrapure water | Milipore | NA | lab filtering systems can induce contamination |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aaldrich | 200-664-3 | standard chemical, no further purification |
| Monovalent salts | Sigma-Aaldrich | standard chemical, no further purification | |
| Lipids | Avanti polar lipids | lipid bilayers formed using stadard protocols | |
| Crystals | MTI | polished crystals | |
| Scotch tape | 3M | Scotch Magic Tape | Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly |
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