활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em> C. 엘레</em> 생식선

여기에 설명 된 프로토콜은 무척추 동물 모델 시스템 C. 대해 우선적 엘레, 그리고 기관에서 정한 모든 윤리적 가이드 라인을 따른다. 1. 동물의 유지 보수 C. 유지 E. 시드 한천 선충 성장 매체 (20, 21) (NGM 참조 자료 표)에 재고 문화를 작업 간스 대장균 OP50. 16 ° C와 25 ° C 사이의 온도에서 웜 주식을 유지한다. 주 : 종종 빠른 성장 속도, 비정상적인 배아 발달 및 하부 브루 크기에서보다 높은 온도의 결과를 웜 배양. 또한, 온도에 민감한 유전자형은 서로 다른 온도에서 서로 다른 표현형을 표시합니다. 잘 공급 웜의 지속적인 공급을 유지하기 위해 자신의 성장 속도에 따라 3 일 – 매 2 새로운 NGM 플레이트로 웜을 전송합니다. 참고 : dpERK 수준을 포함하는 특정 실험을 위해, 웜은 굶어 또는 군중에서 얻을 수 안됩니다에드 판. 크롤 링 기아에 미치는 영향 인슐린은 웜 (22)에 신호 및 인슐린 신호는 ERK (12) 활성을 조절한다. 따라서 굶주린 또는 과밀 판에서 벌레 변수 어려운 재현 염색 패턴 발생합니다. 생식선을 얻기위한 성인 웜 2. 해부 150 WT (N2) 또는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브의 M9 완충액 100 μL의 원하는 특정 발달 단계 (L1, L2, L3, L4, 성인, 등.)의 웜 원하는 유전자형 – 백을 지정. M9 버퍼 900 μL와 microcentrifuge 관 채우기 (재료 표 참조). 주위 온도에서 1 분간 마이크로 원심 1,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 부드럽게 M9 버퍼 900 μL를 제거하고 폐기합니다. 벌레가 실수로 삭제되지 않도록 해부 현미경 버퍼를 제거합니다. 신선한 M9 2.3 두 번 더 할 때마다 버퍼 – 반복 2.2 단계를 반복합니다.이 벌레로 이월 된 모든 세균을 효과적으로 씻어되도록합니다. 최종 세척 후 튜브 및 폐기에서 M9 버퍼 900 μL를 제거합니다. 평면 바닥 유리 시계 접시에 200 μL – 마이크로 피펫 팁 150 웜 – 100를 포함하는 나머지 100 μL M9의 버퍼를 전송합니다. 마이크로 피펫 팁을 사용하기 전에 10 μL 마크에서 절단되어 있는지 확인합니다. 끝이 웜의 전단 발생합니다 절단하지 않습니다. M9 버퍼에 웜을 포함하는 유리 시계 접시에 0.1 M의 levamisole 3 μL – 1을 추가한다. 조심스럽게 벌레가 이동을 중지 할 때까지 혼합도 가능하도록 레바 미솔과 M9 소용돌이 친다. 주 : 레바 미솔 주식 장기 보존에 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 동물의 이동성의 신속한 손실을 얻기 위하여 레바 미솔 0.25 밀리미터 – 0.2 문헌 23에 설명 된 내용 3mm보다 – 여기서, (1)의 높은 농도를 사용한다. 동물이 너무 리터 주위에 채찍 경우옹 액체 현탁액, 생식선에 dpERK의 결과 패턴 (때문에 스트레스 또는 영양 또는이 둘의 부족) 변수가 될 수 있습니다. 해부 3 밀리미터의 levamisole – 더 재현 염색 패턴 1을 달성했다. 이 1 ML의 주사기 (바늘의 게이지가 중요하다 중요하지 않습니다 주사기의 크기)에 두 개의 25 G 바늘을 연결합니다. 각 손에 위치 하나의 주사기 (그림 2). 그림 2와 같이 해부 현미경 하에서 각 웜을 통해 각각의 바늘을 놓고 가위와 같은 동작에서 두 번째 인두 전구 근처 웜에 미세한 상처를 배치합니다. 접시에있는 모든 동물이 한 번 이상 절단 될 때까지 웜에서 한 컷 한 후 다음 동물로 이동합니다. 참고 : – 2.9 시간에 민감한 2.8 단계가 염두해야합니다. 재현 dpERK 패턴에 대한 다섯 분 아래에있는 접시에 모든 벌레를 해부하다. 긴 해부 시간은 특히 Z에서 dpERK 신호의 오프 선회가 발생합니다하나 1. 할당 된 시간 프레임에 머물 해부 (즉, 50 웜 대 150) 필요한 경우 라운드 당 벌레의 수를 조정합니다. 경우 압출 생식선은 해부 동안 같은 동물의 또 다른 상처를 시도하지 마십시오 볼 수 없습니다. 일반적으로 그것은 단지 동물을 전단과 생식선의 압출 발생하지 않습니다. 대신, 다음 동물로 이동합니다. 돌출하지 않는 생식선 섹션 6에서 이루어집니다 및 이미징 동안 무시 될 수있는 슬라이드에 같은 표시됩니다 웜 참고 : 해부 및 처리의 모든 단계를 통해, 그것은 생식선이 몸 / 카 카스에 부착 된 상태로 유지됩니다 명심하는 것이 중요하다. 생식소와 떨어져 바늘로 몸을 강제하지 마십시오. 몸에서 생식선을 절단하기위한 시도에서 종종 배 성선 조직에서 비정상적인 눈물은 가짜 항체 신호가 발생할 수 있습니다. 바디 / 카 커스 이미징 단계 (제 6) 중에 무시 될 수 있으며, 단지 생식선 이미지화. 또한, 솜장 세포는 항체가 분석 될뿐만 내부 통제 / 신체 컨트롤을 제공 할 수 etimes. 3. 생식소 고정 절개가 완료된 후, M9의 100 μL를 함유하는 유리 시계 접시 해부 동물에 직접 3 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 2 mL를 첨가하고 파라 필름으로 커버. 화학 흄 후드에 덮여 시계 유리 접시를 놓습니다. 주의 : PFA는 유해 화학이다. 따라서, 정착 화학 퓸 후드에서 수행되어야한다. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. 일회용 9 "유리 파스퇴르 피펫을 사용하면 해부 동물을 포함하는 시계 유리 접시에 3 ㎖의 1X PBS-T (참고 자료 테이블)의 추가. 믹스 파스퇴르로 해부 동물과 PFA 용액 및 1X PBS-T를 그려서 피펫 조심스럽게 다시 시계 유리 접시에 해제는. 세척하는 동안 튜브를 와동하지 마십시오. FRE 사용SH 유리 파스퇴르 피펫 파스퇴르 피펫으로 시계 유리 접시에서 5 (해부 웜 함유 PFA 및 1X PBS-T)의 액체 용액을 그리고 새로운 5 ㎖ 유리 원추형 튜브에 콘텐츠를 전송. 원심 분리기 1,000 X g에서 임상 원심 분리기에서 30 초 동안 원뿔 튜브. 유리 파스퇴르 피펫과 원뿔 튜브를 사용으로 해부 생식선 플라스틱에 충실. 제거하고 해부 동물을 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 버린다. 해부 생식선에 영향을 미치지 않도록 해부 현미경 원뿔형 튜브에서 각각 세척 한 후 액체를 제거하고, 그 손실을 최소화한다. 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하여 원뿔 튜브에 5 mL의 1 배 PBS-T를 추가합니다. 원심 분리기 1,000 × g으로 30 초 동안 임상 원심 분리기에서 원뿔 튜브. 제거하고 해부 동물을 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 버린다. 3 회 총 단계를 반복 3.7. 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하여 100 %의 2 mL를 넣고튜브에 메탄올, 부드럽게는 파스퇴르 피펫으로 그리기하여 메탄올 생식선을 섞는다. 1 시간 이상 동안 -20 ℃에서 튜브를 부화. 참고 : 해부 생식선은 dpERK 염색에 대한 최대 2 일 동안 메탄올에 저장할 수 있습니다. 2 개 이상의 일 2 주까지 보관이 아닌 dpERK 항체, 안티 라민 항체와 같은 다른 항체 염색 응용 프로그램과 호환됩니다. 원하는 배양 시간 후, 생식선 세척하기 위해 총 3 회 반복 단계 3.7. 세척하는 동안 튜브를 와동하지 마십시오. 최종 세척 후 5 ML 원뿔 튜브에 1X PBS-T의 500 μL를 둡니다. 신선한 파스퇴르 피펫 신선한 1 mL 유리 튜브 (6mm × 50 ㎜)로 원추형 유리관의 내용을 전송하여. 10 분 – 해부 동물 5 중력에 의해 해결하도록 허용합니다. 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하여 해부 현미경, 1 mL의 유리 튜브 기지에서 가능한 한 세탁의 한 많이 제거심은 해부 생식선을 방해. 4. 차단 및 차 항체 치료 30 %의 100 μL를 1X PBS-T에 희석 정상 염소 혈청 (NGS)를 추가 1 mL 유리 튜브 해부 동물 (재료 표 참조). 30 % NGS 블로킹 버퍼로서 기능한다. 액체의 증발을 방지하기 위해 파라 필름 튜브 커버. 1 시간 또는 4 ° C에서 하룻밤 실온에서 품어. 배양 원하는 시간 후, 가능한 한 많은 액체를 제거하고 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하여 블로킹 완충액을 제거한다. 생식선이 파스퇴르 피펫로 작성되지 않도록하기 위해 해부 현미경을 사용합니다. 30 % NGS 400 : 1에서 (dpERK이 메소드에 언급 된 재료 표를 참조) MAPKYT 항체를 희석. 튜브 당 100 μL를 사용하기에 충분한 항체 희석을 준비합니다. 미사용, 희석 항체를 일주일에 4 ℃에서 저장 될 수있다. 희석 방지 dpERK 항체의 100 μL를 추가하기 때문에해부 동물을 함유하는 1 ㎖의 유리 튜브 lution. 파라 필름으로 튜브를 밀봉합니다. 4 ℃로 하룻밤에 튜브를 품어. 밤새 배양 한 후, 실온에서 튜브에 1X PBST 800 μL를 추가합니다. 신선한 유리 파스퇴르 피펫에 샘플을 작성하고 생식선이 균등하게 1X PBS-T에 현탁되도록 부드럽게 놓습니다. 생식선 중력과 바닥에 정착하자. 뜨는을 제거합니다. 이 해부 생식선 씻어하지만 과정에서 손상되지 않았는지 확인합니다. 세 세척의 총 4.6 – 반복 4.5 단계를 반복합니다. 세척하는 동안 튜브를 와동하지 마십시오. 세 번째 세척 후 제거하고 해부 동물을 방해하지 않고 가능한 한 많이 뜨는 폐기해야합니다. 신선한 파스퇴르 피펫마다 사용되어 있는지 확인합니다. 5. 차 항체 치료 차 항체 동안 세척 보조 항체 희석을 준비합니다. 항 – 마우스 희석 SE1에서 condary 항체 : 500 30 % NGS. 차 항체와 마찬가지로, 튜브 당 100 μL를 사용합니다. 않는 항체를 일주일에 4 ℃에서 저장 될 수있다. 해부 동물을 함유 한 용액의 유리관에 100 μL 차 항체 용액을 추가한다. 파라 필름 각 튜브를 커버하고 어두운 튜브의 내용을 유지하기 위해 알루미늄 호일에 튜브를 감싸는. 2 시간 동안 실온에서 튜브를 품어, 또는 대안 밤새 4 ° C에서. 배양 원하는 시간 후, 튜브에 1X PBS-T의 800 μL를 추가하고 반복 4.5 단계 – 3 회 총 4.6. 최종 세척 후 제거하고 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하여 해부 현미경으로 가능한 한 상층 액만큼을 버린다. 이차 항체에 대한 세척시 DAPI 솔루션을 준비합니다. 1X PBST 1 mL의 IN- (-20 ° C에서 보관 1 ㎎ / ㎖의 1000 배 재고에서) DAPI의 1 μL를 희석. 을 함유하는 튜브로 희석 DAPI 용액 800 μL를 추가해부 동물. 파라 필름 튜브의 입구를 커버하고, 알루미늄 박의 각 튜브를 감싸는. 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. 해부 동물을 방해하지 않도록 DAPI와 인큐베이션 후, 해부 현미경 신선한 파스퇴르 피펫 가능한 DAPI 용액만큼 제거한다. 튜브에 솔루션을 장착 한 방울을 추가합니다. 알루미늄 호일의 각 튜브를 감싸. 참고 : dpERK 염색을 시각화를 들어, 스테인드 생식선 즉시 현미경 마운트해야합니다. 이러한 인산화 된 세린 (10) 히스톤 H3 다른 항체 응용 프로그램의 경우, 생식선은 어둠 속에서 4 ° C에서 최대 2 주 동안 미디어를 장착 유지 될 수있다. 6. 조립 슬라이드 및 이미지 .도 3에 도시 된 바와 같이 두 유리 현미경 슬라이드 (25mm X 75mm X 1mm)의 위쪽에 세로 랩 테이프의 층을 배치 두 테이프 슬라이드 사이에 새로운 깨끗한 유리 현미경 슬라이드를 배치했다. 참고 : 두께테이프의 중간 슬라이드에 아가로 오스 패드를 생성하는 데 도움이됩니다. 테이프가 아가 패드를 만들기위한 스페이서로서 기능으로서 아가 패드의 두께는 테이프와 거의 동일하다. 중간에 현미경 슬라이드에 드롭 용융 2 % 아가로 오스의 ~ 200 μL (증류수 제). 빨리 아가로 오스의,에 수직 및 상단에, 신선한 깨끗한 슬라이드를 배치합니다. (- 2 분 1) 아가로 오스이 응고하자. 아가로 오스 패드가 파괴되지 않도록 매우 조심스럽게 상단 현미경 슬라이드를 제거합니다. 아가로 오스 패드 상단 또는 하단 슬라이드에 하나 부착 된 상태를 유지 할 수 있습니다. 아가로 오스 패드로는, 아가로 오스의 매끄러운 표면 한, 부착 남아 슬라이드하는 중요하지 않습니다. 파스퇴르 피펫 아가로 오스 패드에 해부 동물을 전송 사용. 해부 현미경 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드에서 초과 액체를 제거합니다. 생식선과 장을 누르면, 속눈썹의 머리카락이나 미세하게 그려 모세관을 사용하여슬라이드의 생식선을 확산하기 위해 서로 방법. 24mm X 50mm 크기의 커버 슬립과 현미경 슬라이드를 커버. 커버 슬립이 최소한의 기포가 커버 슬립 및 슬라이드 사이에 형성되는으로 슬라이드에 부드럽게 저하 될 수 있도록주의하십시오. 슬라이드 상자에 밤새 4 ° C (슬라이드가 coverslip에 평평 거짓말 불투명 슬라이드 상자)에서 스토어를 초과하는 액체가 증발하고 생식선이 (인해 생식선에 커버 슬립의 무게에) 다소 평평 될 수 있도록합니다. 생식선의 약간의 평탄화는 달리 라운드 생식 관의 더 나은 이미징 수 있습니다. 커버 슬립을 장착하면, 손가락으로 커버 슬립의 상부에 압력을 적용하지 않는다. 종종 이것은 생식기 및 dpERK 신호의 손실의 왜곡을 초래한다. 만 더 효과적인 이미징 하룻밤 생식선을 평평하게. 슬라이드는 즉시이 조립으로 볼 수 준비가 된 것입니다. 바로 이미지를 사용하려면, 부드럽게 흡수커버 슬립 깨끗한 실험실 조직을 사용하여 모서리에서 슬라이드 사이의 초과 액체. 밤새 기간 후, 슬라이드를 밀봉 커버 슬립 슬라이드 경계의 네 모서리에 투명 매니큐어 탑 코트와 커버 슬립. 매니큐어 / 커버 슬립 씰은 커버 슬립 이미징 동안 이동하지 않는 것을 보장하고 샘플의 파괴를 방지합니다. 이미지 63X에서 복합 현미경 생식선. 그러나 대물 렌즈의 현미경은 현미경 사용자 애플리케이션의 이용 가능성에 기초하여 변화 될 수있다. 난 모세포의 증식 영역에서 전체 생식선의 크기는 하나의 이미지에서 캡처 될 수있는 것보다 크기 때문에,도 4. 11 ~ 14, 18에 도시 된 바와 같이, 이미지가 중첩 경계 몽타주로 간주된다. 많은 경우에, 긴 별다른 변화가 생식선 이미지하지 한, 최종 이미지 및 조립 후 카 커스를 편집. 스토어 t조립 된 이미지를 따라 그는 원시 이미지는 '이전'조립 / 편집의 비교 및 ​​이미지의 어셈블리 '후'/ 편집을 활성화합니다. 주 : 현미경 이미지가 몽타주를 조립하는 동안 신호 강도 나 채도에 대해 변경 될 수 없습니다.