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Biochemistry

On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline

Published: January 05, 2017
doi:
10.3791/54861
, ,
1Structural Biology Group,European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences,Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes,Institut de Biologie Structurale

Summary

A determinação da estrutura da solução de proteína por um pequeno ângulo de dispersão de raios-X (SAXS) requer amostras monodispersas. Aqui, apresentamos duas possibilidades para assegurar atrasos mínimos entre a preparação da amostra e aquisição de dados: cromatografia em linha de exclusão de tamanho (SEC) e cromatografia de troca iônica em linha (IEC).

Abstract

pequeno ângulo de dispersão de raios X Biológica (BioSAXS) é uma técnica poderosa em biologia molecular e estrutural usado para determinar a estrutura solução, tamanho e forma das partículas, e a relação de superfície-para-volume de macromoléculas. A técnica é aplicável a uma ampla variedade de condições de solução que abrangem uma ampla gama de concentrações, valores de pH, temperaturas, forças iónicas, aditivos, etc., mas a amostra é necessário para ser monodispersa. Esta ressalva levou à implementação de sistemas de cromatografia líquida de linhas de luz SAXS. Aqui, nós descrevemos a integração a montante do de exclusão de tamanho (SEC) e a cromatografia de permuta iónica (IEC) numa linha de luz, métodos diferentes para a subtracção de fundo óptima, e a redução de dados. Como exemplo, descreve-se como usamos sec- e IEC-SAXS em um fragmento da proteína do vírus vaccinia essencial D5, que consiste de um domínio D5N helicase. Determinamos a sua forma global e o peso molecular, que mostra a estrutura hexamérica de the proteína.

Introduction

BioSAXS é uma ferramenta poderosa para determinar a forma de objectos de tamanho nano-1-4. A dispersão de raios-X por uma solução contendo macromoléculas, dimensionadas na gama nm, é gravado em ângulos muito baixos. Esta gama angular contém informações sobre parâmetros globais: o raio de giro; a maior distância intraparticular; A forma da partícula; e o grau de dobragem, a desnaturação, ou distúrbio. A técnica não requer cristais, e a macromolécula estadias em solução e, portanto, pode ser mantido em condições que imitam certos parâmetros importantes de célula, tais como força iónica, pH, etc. O conhecimento destes factores poderia ajudar a determinar, por exemplo, o estado oligomérico fisiologicamente relevante de uma proteína de interesse ou para validar um modelo proposto de um complexo. A caracterização de interacções proteína-proteína em diferentes condições de tampão, a criação de modelos de domínios em falta, o refinamento de modelos de homologia, e o derescisão de estados dobrada e desdobrada discretos podem ser realizadas rapidamente e facilmente 5.

Tal como acontece com qualquer técnica, BioSAXS tem debilidades intrínsecas: Amostras de agregados ou desnaturados, misturas de partículas, amostras heterogéneas, os danos da radiação, e os desajustes de buffer pode resultar em dados un-interpretável. Para muitos métodos de análise, assume-se implicitamente que a amostra é monodispersa, um requisito que é muitas vezes difícil de obter na prática. Em muitos casos, a degradação da amostra é subtil e não pode ser detectado nos dados sobre o seu próprio, e qualquer tentativa para interpretar os dados dá resultados imprecisos ou mesmo enganosos. Para superar esses obstáculos, a combinação de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e SAXS foi implementado em muitas linhas de luz para garantir a qualidade dos dados e tornar esta técnica mais acessível para as amostras de cada vez mais difíceis 6-11. Recentemente, nós adicionamos um novo método para o repertório através do desenvolvimento de íon-troca on-linecromatografia (IEC) -coupled SAXS 12. Ambas as técnicas são SAXS abertura para uma ampla gama de partículas biológicas anteriormente impossível analisar. A escolha de qual método usar depende das propriedades biofísicas das partículas de interesse.

SEC separa macromoléculas pelo seu tamanho, em que é necessária pelo menos uma diferença de 10% na massa molecular aparente para a separação. limitações físicas da coluna e as propriedades fisiológicas das amostras, como superfícies hidrofóbicas, flexibilidade e falta de estabilidade, também complicam a coleta de dados, análise e interpretação.

Cromatografia de permuta de iões, o que separa as moléculas com base na sua carga e, por conseguinte, a sua afinidade de ligação para a coluna de IEC, podem ser utilizados em vez de ou em adição a SEC. A carga total pode ser facilmente manipulado por alteração do pH, ou variando a concentração de sal do tampão, fornecendo um método relativamente simples para o el controladabuição das moléculas a partir da coluna de IEC. Ao utilizar a carga, a separação de tipos semelhantes e tamanhos de moléculas, que de outra forma seriam difíceis de separar, pode ser realizada rotineiramente com a norma IEC. Além disso, a IEC tem a vantagem de ser capaz de lidar com as amostras diluídas, permitindo que se possa evitar os passos de concentração, que carregam o risco potencial de desnaturação da proteína. Infelizmente, como a distribuição de carga é altamente amostra-dependente, IEC exige otimização quanto ao pH e as concentrações de sal 13,14.

Para muitas proteínas que são difíceis de expressar, purificar, ou ambos, apenas pequenas quantidades de amostra estão disponíveis para estudar. É importante para ser eficaz e minimizar o número de passos de purificação e, por conseguinte, as perdas. Por esta razão, o último passo de purificação é directamente em linha antes da aquisição de dados de SAXS, a fim de aumentar a probabilidade de recolha de um bom conjunto de dados.

Aqui, Apresentamos e comparar on-line SEC-SAXS e IEC-SAXS. Ambas as técnicas foram implementadas na linha de luz BioSAXS BM29 no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) em Grenoble, França 15. Tal como um caso de teste, utilizou-se o domínio D5N e helicase da proteína do vírus vaccinia D5, que foi bastante difícil de analisar estruturalmente usando outros métodos. O vírus de vaccinia é um membro da família Poxviridae e é 98% idêntica ao vírus da varíola, a causa da varíola. Usando o sistema de vaccinia, estudamos o mecanismo de replicação, concentrando aqui no D5 essencial helicase-primase.

D5 é uma proteína de 95 kDa com uma primase ARCHEO-eucariótica (AEP) do domínio N-terminal 16 seguida por uma região de grupos de cisteína (res. 240-345) 16. Mais na direcção da extremidade C-terminal vem um domínio D5N (res. 340-460), que está sempre associada com helicases do tipo D5, e, finalmente, uma superfamília 3 (PC3) domínio da helicase (res. 460-785) 17 (Figure 1A). O domínio da helicase da D5 constrói uma estrutura hexamérica anel que é necessário para a ligação forte ao ADN. Graças a recentes estudos de SAXS e EM, as estruturas de baixa resolução da primase e helicase os domínios são agora conhecidos 18.

Aqui, vamos mostrar como usar as técnicas de cromatografia em linha implementadas na linha de luz BioSAXS BM29 no ESRF para obter insights sobre a estrutura do fragmento C-terminal (resíduos 323-785) de D5.

Protocol

1. Descrição da Preparação off-line e a geração de amostras de uma proteína D5 Supressão NOTA: O constructo D5 323-785 (Figura 1A) foi clonado, expresso e purificado como descrito 18. Clonar a construção no vector pPROEX HTB Realizar uma reação em cadeia da polimerase (PCR) em D5R usando os "-5'ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3 e 'iniciadores 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 e uma mistura da PCR com polimerase, seguindo o conselho do fabricante. Purificar os fragmentos de PCR através de colunas de spin, seguindo o conselho do fabricante. Digerir os fragmentos de PCR e o plasmídeo com Ncol e as enzimas de restrição HindIII, seguindo as recomendações do fabricante para a composição do tampão e do tempo de incubação. Executar os fragmentos num gel de agarose a 1% em tampão TAE 0,5x (20 mM de Tris, 10 mM de ácido acético,e 0,5 mM de EDTA) e corar o gel com um corante de ADN. Expor o gel à luz UV. Cuidado: Use equipamento de segurança pessoal! Cortar as bandas dos fragmentos de PCR digerido e o plasmídeo digerido e purifica-se o ADN utilizando um kit de purificação por coluna de centrifugação em gel, seguindo as recomendações do fabricante. Ligar os fragmentos de PCR purificados no plasmídeo utilizando um kit rápido de ligação, seguindo as recomendações do fabricante. Transformação através de choque térmico do produto a partir da reacção de ligação em bactérias competentes optimizados para amplificação do plasmídeo. Adicionar metade do produto de ligação a um frasco de bactérias. Incubar o tubo de reacção em gelo durante 20 min. Incubar o tubo a 42 ° C durante 30 s. Colocar o tubo em gelo durante 2 min. Adicionar 1 ml de Luria Bertani (LB) Caldo (Miller) sem antibióticos e deixar as células recuperar a 37 ° C durante 1 h. Girar as células a 16.100 xg for 3 s em um microtubo centrífuga de mesa e remover a maior parte do meio. Espalhe as células numa placa de agar de LB com ampicilina (50 ug / ml final) e deixar que as colónias crescem a 37 ° C durante a noite. Coloque uma colónia em 3 mL de LB com ampicilina (50 ug / ml final) e a cultura crescer a 37 ° C, agitação a 160 rpm durante a noite. Seguir as instruções do kit miniprep para extrair o plasmídeo. Envia uma amostra do plasmídeo para sequenciação e análise da sequência para a ausência de mutações e para a inserção correcta. Transformar o pPROEX HTB D5 323-785 construir em bactérias otimizadas para a expressão da proteína (use 1 mL e siga os passos no passo 1.1.7). Espalhe as bactérias sobre uma placa de agar LB com ampicilina (50 ug / ml final). Para criar uma cultura de partida, colocar uma colónia em 300 mL de LB com ampicilina (50 ug / ml final) e crescer as bactérias a 37 ° C, agitação a 160 rpm durante a noite. Inocular 12 x 1 L de LB na presença de ampicilina (50 ug / ml final), cada uma com 20 mL da pPROEX HTB D5 323-785 bactérias cultura inicial a 37 ° C até uma OD 600 = 0,3 seja alcançado. Reduzir a temperatura a 18 ° C e induzir a expressão a uma DO 600 = 0,5 com IPTG 1 mM. Incubam-se as culturas, agitando-os a 160 rpm e 18 ° C durante a noite. Colher as bactérias por centrifugação a 50.000 x g e a 4 ° C durante 30 min. Ressuspender as peletes bacterianos em aproximadamente 150 ml de tampão de lise (50 mM de Tris-HCl [pH 7], NaCl 150 mM, MgCl2 5 mM, mM β-mercaptoetanol 10, e glicerol a 10%) com o inibidor da protease 1x e 25 unidades ( L) / 10 ml de DNase. Lisar as bactérias através de sonicação em gelo (sonda de 1 polegada, o poder de 50%, 0,5 s de pulso, 0,5 s de pausa, 3x 5 min). Carregar o sobrenadante numa coluna de afinidade de níquel (Ni-coluna, volume de leito de 1,5 ml), e lavá-la com 10 volumes de coluna (CV) de btampão inding (Tris-HCl 50 [pH 7], NaCl 150 mM, β-mercaptoetanol 10, e 10% de glicerol), 10 VC de tampão de lavagem (Tris-HCl 50 [pH 7], NaCl 1 M, 10 β-mercaptoetanol mM e glicerol a 10%), e 10 CV de lavagem com imidazole a (Tris-HCl 50 [pH 7], NaCl 150 mM, β-mercaptoetanol 10, 10% de glicerol, e imidazol 30 mM). Eluir a D5 323-785 (Tris-HCl 20 [pH 7], NaCl 150 mM, β-mercaptoetanol 10, 10% de glicerol, e imidazole 200 mM). Inspeccionar os diferentes passos de purificação através de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Carga 2-20 uL de cada passo de purificação de fluxo misturado com o corante de carga 1x (2x: 4% de SDS, 20% glicerol, Tris-HCl 120 [pH 6,8], e 0,02% peso / volume de azul de bromofenol) em um 10 % de SDS em gel e executá-los a 200 V, em tampão de corrida 1x Laemmli (Tris 25 mM, glicina 0,192 M, e SDS a 0,1%). Corar o gel com uma solução de azul de Coomassie pronto-para-uso. exchange o tampão da proteína eluída com tampão de ligação usando uma coluna de dessalinização de acordo com o manual do fabricante. Clivar o His-tag, adicionando Vírus Etch do Tabaco nuclear inclusão-uma endopeptidase (TEV, 1 mg / 100 mg de proteína) à solução de proteína. Incubar à temperatura ambiente durante a noite. Verifique a digestão através da realização de SDS-PAGE (veja o passo 1.5) Equilibrar a coluna de Ni-em tampão de ligação. Deixe a solução de proteína de passar através e lavar os grânulos com 2 VC de tampão de lavagem imidazol, recolhendo o fluxo de passagem. Concentra-se a proteína utilizando um concentrador centrífugo para um volume final de 0,5 mL. Injectar a proteína concentrada numa coluna de exclusão de tamanho equilibrada com tampão de filtração em gel (Tris-HCl 20 [pH 7], NaCl 150 mM, glicerol a 10%, e ditiotreitol 1 mM [DTT]). Recolhe-se o fluxo de passagem em 0,5 ml de fracções. Verificar a presença e pureza da proteína nas amostras de pico porrealização de SDS-PAGE (veja o passo 1.5). Combinar as fracções do pico eluído de D5 323-785. Dilui-se a amostra a 25 mM de NaCl e 5% de glicerol, mantendo as concentrações de Tris e DTT constante (para 5 mL de solução de proteína em Tris-HCl 20 [pH 7], NaCl 150 mM, glicerol a 10%, e 1 mM de DTT, em primeiro lugar adicionam-se 5 mL de Tris-HCl 20 [pH 7], e 1 mM de DTT, e, em seguida, adiciona-se 20 mL de Tris-HCl 20 [pH 7], 5% de glicerol e DTT 1 mM). Carregar a amostra numa coluna de permuta iónica. Utilize tampão A (Tris 20 mM [pH 7], 25 mM de NaCl, 5% de glicerol e DTT 1 mM) e tampão B (Tris 20 mM [pH 7], 1 M de NaCl, 5% de glicerol, e 1 mM de DTT) para formar um gradiente de sal de 25 mM a 1 M. Recolha a proteína eluida em 1,5 mL fracções. Verificar a presença e pureza da proteína nas amostras de pico através da realização de SDS-PAGE (ver passo 1.5 e a Figura 1B) Reconcentrar a solução de proteína num concentrador centrífugo para um volume final de 0,5 mL. rerun a proteína concentrada numa coluna de exclusão de tamanho em tampão de filtração em gel (Tris-HCl 20 [pH 7], 150 mM de NaCl, 5% de glicerol e DTT 1 mM; ver passo 1.11). 2. Coleta de Dados NOTA: O tempo de feixe Pedido tão cedo quanto possível. Para ESRF, orientações sobre os tipos de acesso disponíveis e sobre como apresentar um pedido podem ser encontradas em: http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Após a aceitação da proposta e um convite para o experimento, todos os participantes têm de completar um treinamento de segurança. Após a validação da formação, preencher o "A-forma" (através do portal do usuário ESRF) para declarar os pesquisadores visitam a linha de luz para o experimento, juntamente com as informações de segurança necessárias sobre as amostras. Entre em contato com a pessoa de contato local para discutir o experimento. Coleta de dados SEC-SAXS NOTA: Para onlpurificação ine, use o sistema de alto desempenho cromatografia líquida (HPLC) instalado no BM29. O sistema consiste de um desgaseificador em linha, uma bomba binária, uma válvula de selecção de tampão e gradientes, um amostrador automático, um photospectrometer gama de UV-VIS e um conductometer. Ele está directamente ligado ao capilar de fluxo através da unidade de exposição 19 SAXS. Colocar 1 ml do tampão de filtração em gel de lado. Conectar-se a garrafa de tampão para o sistema SEC (o padrão é Port A). Escolha a taxa de fluxo de acordo com a coluna a ser utilizada. Nota: Para a coluna de exclusão de tamanho utilizado aqui, a taxa de fluxo é de 0,1 ml / min. Defina a pressão máxima para a coluna, tomar nota da contra-pressão, e definir o tempo de aquisição de pelo menos 1,2 CV. Lave as bombas e os tubos a montante através da função "auto-limpeza". Espere até que o sistema é cheio com o tampão e ligar à coluna. Equilibrar a coluna por passagem de pelo menos 1,5 CV. intertravamentoa gaiola e medir o buffer de lado no passo 2.1.1, usando o trocador de amostras para controlar a variação do sinal devido a danos causados ​​pela radiação. Apenas continuar, se não houver danos da radiação para o tampão. Mudar o sistema de controle beamline para o modo de HPLC. Faça um teste de tampão, a coleta de 200 frames com 1 s por quadro. Anote o número de contagens dadas pelo detector na trama intensidade somados. NOTA: O sinal deve coincidir com o tampão medido anteriormente, ea intensidade somadas ao longo do tempo deve permanecer constante. Se o sinal não coincidir ou não é constante, uma maior equilíbrio do sistema é necessária. Girar a amostra a 13000 x g numa centrífuga de mesa microtubo durante pelo menos 10 min. Encha a amostra em um frasco de vidro HPLC-compatível (fornecido) e colocá-lo na auto-injector. Observe a posição também. Entrelace a gaiola experimental utilizando um procedimento padrão, conforme explicado no treinamento de segurança do usuário. Faça o login no e crie uma pasta para armazenamento de dados através do software de controle de linha de luz. Programar o sistema HPLC usando o recurso de "quick lote". Definir o local de armazenamento para os dados de UV para a pasta criada no passo 2.1.10. Certifique-se de ativar a conversão ASCII automática dos dados UV, armazenar o arquivo ASCII na mesma pasta. Escolha o volume de injeção ea posição também. Adicionar a medição para a fila ao pressionar o botão "Start". O software irá pedir para salvar o lote. Prepare-se para salvar, mas não pressione o botão "Save", já que este começa automaticamente a medição. Configurar os parâmetros de recolha de dados no software de controle de linha de luz. Escolha do número de armações de modo que o tempo total de recolha de dados está em ligeiro excesso do tempo de aquisição definido no passo 2.1.2. Abrir o obturador de segurança e começar a coleta de dados de SAXS usando o software de controle de linha de luz. Verifique se os dados são cortamente adquiridos. Compare os dados recém-colhidos com os dados coletados na etapa 2.1.6 e verifique se o número de contagens na intensidade resumiu permanece constante durante pelo menos 100 quadros e coincide com o valor da etapa 2.1.6. Comece o SEC executado pressionando o botão "Save", como preparado no passo 2.1.11, e anote o número do quadro exibido no software camserver quando a injecção está concluída e aquisição de dados UV começa. Após a coleta de dados, abra o banco de dados ISPyB 20 a Abra a aba "aquisição de dados" e pressione o botão "Go" para acessar o conjunto de dados e os resultados da análise automática 21. Coleta de dados IEC-SAXS Nota: Em vez de o gradiente linear contínuo vulgarmente aplicado em experiências IEC, usar um gradiente passo a passo no qual a quantidade de tampão B é aumentada em passos discretos pré-definido. Criar o programa de HPLC para um sample-livre tampão de corrida. Programar um gradiente passo a passo a partir de 0% tampão B e um aumento de 5 pontos percentuais depois das duas CV até 100% de tampão B é atingido. Ponha um pouco de cada buffer de lado. Conectar-se a garrafa com o baixo teor de sal tampão A para o canal A e aquele com o alto teor de sal tampão B para o canal B. Escolha a taxa de fluxo e permanecer abaixo do limite de pressão da coluna (neste exemplo, 1 mL / min). Como no passo 2.1.3, lave as bombas e tubagens a montante, usando a função "auto-limpeza". Equilibrar o sistema em tampão de baixo teor de sal A (veja o passo 1.15) e ligar a coluna de troca iônica. Aguardar até que a coluna é completamente equilibrada (de pelo menos 1,5 CV). Use o buffer de lado na etapa 2.2.2 para examinar tampões A e B para os danos da radiação usando o trocador de amostras, como no passo 2.1.5. Verificar o tampão que sai da coluna, como no passo 2.1.6. Comparar o sinal para o sinal de tampão A gravado no passo 2.2.6. Note novamente onúmero de contagens na trama intensidade somados. Crie uma pasta para armazenamento de dados para o buffer de execução. Configurar recolha de dados em modo de sistema de HPLC. Escolha do número de armações de modo que o tempo total de recolha de dados está em excesso do tempo total da corrida IEC (ver o passo 2.2.1). Abrir o obturador de segurança e iniciar a coleta de dados de SAXS. Verifique se ela procede corretamente e verifique que a intensidade resumiu permanece constante no valor anotado na etapa 2.2.7, pelo menos, 100 quadros. Use o recurso "Single Run" do software HPLC e iniciar o gradiente passo a passo programado na etapa 2.2.1. Para a injecção, defina o número frasco para -1, a fim de injetar nenhuma amostra nesta etapa. Anote o número de quadros adquiridos a partir do início do programa. Criar o programa de HPLC para a amostra de execução. Programar um gradiente passo a passo a partir de 0% de tampão B. estimar a percentagem de tampão B em cada pico medido desligada na etapa 1.1.5 ( <strong> Figura 1B). Defina pelo menos 3 etapas exatamente 1 ponto percentual abaixo e 1,5 pontos acima dos picos de interesse, cada um para 2,5 CV (Figura 1C). Adicionar uma etapa final a 100% de tampão B em 2,5 CV. Girar a amostra a 13000 x g numa centrífuga de mesa microtubo durante pelo menos 10 min. Diluir D5 323-785 para a concentração de sal do tampão A (25 mM), misturando-o com Tris-HCl 20 [pH 7], 10% de glicerol e DTT 1 mM. Carregar a amostra manualmente para a coluna. Colocar o tubo de tampão A entrada para a amostra diluída depois da pausa das bombas para evitar a formação de bolhas de ar. Desligar a coluna a partir dos detectores de recolher directamente o fluxo através da coluna. Quando o recipiente da amostra é quase vazio, devolver o tubo de entrada em tampão A (de novo parando as bombas enquanto se move o tubo) e reiniciar o bombeamento com tampão A para transferir a amostra a partir da tubagem para a coluna. Uma vez que toda a amostra foicarregado, passar 2 CV de tampão A, e volte a ligar a coluna para os detectores. Para o exemplo de execução, crie uma pasta para armazenamento de dados. Abrir o obturador de segurança e iniciar a coleta de dados de SAXS. Verifique se a coleta de dados procede corretamente e verifique que a intensidade resumiu permanece constante no valor anotado na etapa 2.2.7, pelo menos, 100 quadros. Use o recurso "Single Run" do software HPLC para iniciar o gradiente passo a passo programado na etapa 2.2.12. Para a injecção, defina o número frasco para -1, a fim de injetar nenhuma amostra nesta etapa. Anote o número de quadros adquiridos a partir do início do programa. "Aquisição de dados" Open in ISPyB 20 e pressione "Go" para olhar para o conjunto de dados e análise automática 21. Exportar os dados de UV a partir do sistema de HPLC para o formato ASCII através do software "Análise Postrun". 3.SEC-SAXS Redução e Análise de Dados Abra os dados em aquisição de dados em ISPyB premindo o botão "Go". Determinar na visão geral de quais quadros da recolha de dados de SAXS correspondem ao pico de eluição. Verificar que o raio de giração é estável ao longo do pico. Confirmar que a correção tampão automatizado foi realizado corretamente. Quadros de carga a partir da parte central do pico para um programa que executa as manipulações com os dados experimentais de SAXS arquivos 22 e média-los. Em seguida, carregar o arquivo de buffer gerado automaticamente e verificar se as regiões de alta q dos quadros médios e a partida quadros de buffer. Compare os quadros adquiridos ao longo do pico quantitativamente utilizando o teste CORMAP 23. Coloque as subtrações criadas automaticamente (arquivos * _sub.dat) de quadros que cobrem a região de interesse. Dimensioná-los uns aos outros, premindo o botão "Scale". Comparenviar um e-los usando o recurso de "Comparação de dados". Não deve haver mudanças sistemáticas entre os quadros ao longo do pico. Abra todas * -_ quadros sub.dat de interesse, fundi-los utilizando o botão "Merge" e salve o arquivo mesclado em formato .dat. Determinar o raio de rotação com o "raio de giro" ferramenta no programa, anotando o primeiro ponto de dados na faixa Guinier para recorte posterior dos dados em baixa resolução. Determinar a função de distribuição par-distância com a função "Distribuição Distância" no programa e salve o arquivo .out resultante como gnom.out. 4. ab initio Modeling Em uma máquina Unix, execute um programa de reconstrução de 40 x ab initio modelo sem restrições de simetria. Crie uma nova pasta e copie o arquivo gnom.out a ele. Execute o programa da seguinte forma: para ((i = 1; i <= 40; i ++)); fazer dammif gnom.out -ms -p dammifp1_ $ i; dum Analogamente, execute um programa ab initio modelo de reconstrução com restrições de simetria para simetria de seis vezes em uma segunda pasta: para ((i = 1; i <= 40; i ++)); Do dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ i; feito Alinhar todos os arquivos de saída do programa ab initio modelo de reconstrução (* -1.pdb). Nas duas pastas a partir de passos 4.1 e 4.2, execute damaver -a * -1.pdb. Abra a união de todos os modelos (damaver.pdb), bem como o modelo filtrou-se para o volume correcto (damfilt.pdb) em um software de visualização molecular adequado 26 e compará-los. Abra o arquivo damsel.log em um editor de texto. O modelo listado como a "referência" na parte inferior do arquivo é o modelo mais representativo. 5. IEC-SAXS Redução de Dados, Análise e Modelagem No programa que executa a manipulação com arquivos de dados de SAXS experimentais 22, carregar cerca de 50 SAXS quadros de cada etapa de mistura deo tampão de corrida, pressione o botão "médio", e salvar os resultados. Com base nos resultados de auto-processamento disponíveis através ISPyB, identificar quais os quadros da experiência correspondem a eluição da proteína e verificar que o (preliminar) raio de giração é estável ao longo do pico. Coloque os quadros para o experimental SAXS programa de arquivos de dados de manipulação de 22 e média-los, como foi feito para os quadros de buffer (veja o passo 5.1). Em seguida, carregar os ficheiros de memória intermédia gerados no passo 5.1 e comparar as regiões High Q (acima de 4,2 nm, -1) para localizar uma memória intermédia que corresponde à média do pico. NOTA: Não deve haver nenhuma diferença entre a média do pico eo buffer sistemática. Se a curva da amostra parece situar-se entre duas curvas de amortecimento, interpolar as suas curvas através do cálculo da média. Subtrair o tampão identificada como a melhor correspondência a partir da curva média de dispersão da fração de pico e salvar o subtr resultantearquivo agiu. Além disso, criar curvas subtraídas utilizando as curvas médias tampão dos anteriores e seguintes passos de mistura para estimar a margem de erro da subtração. Repita os passos 5.3 e 5.4 individualmente para as metades esquerda e direita do pico e comparar os resultados com aqueles do passo 5.4 para verificar a estabilidade do sinal ao longo do pico. Siga os passos 3.5 e 3.6 para todos os três curvas subtraído do passo 5.4. Comparar os resultados para todas as três curvas subtraídos. Nota: Somente os resultados que permanecem robustos dentro da margem de erro da subtração pode ser confiável. Realizar a modelagem de como nos passos 4.1 e 4.2 para o melhor subtração identificado no passo 5.3. Siga o passo 4,3-4,5 para alinhar os modelos e identificar o mais representativo. 6. Comparação dos resultados Executar um programa para sobrepor estruturas 3D 12 nos modelos representativos da SEC (passo 4.5) umadados d IEC-SAXS (passo 5.9) com simetria P6: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb Importar o model_sec.pdb eo model_iec-r.pdb em um software de visualização molecular. Abra os arquivos .fir do modelsec.pdb eo modeliec-r.pdb em uma planilha e criar um gráfico 2D de curvas de dispersão experimentais e calculados.

Representative Results

Os resultados da análise invariante livre de modelo estão listadas na Tabela 1. A análise dos dados de SEC-323-785 SAXS D5 mostrou uma estimativa da massa molecular (a partir de uma análise Porod) de 345 kDa contra 338 kDa, observada utilizando IEC-SAXS. Ambos estão de acordo com a massa esperada de 6 vezes de 53,5 kDa (321 kDa) para um hexâmero. A modelagem ab initio de ambos os conjuntos de dados foi realizada sem simetria imposta (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) e utilizando simetria C6 (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Como os ataques gerais para os dados de dispersão para ambas as reconstruções são comparáveis em ambos os casos (Figura 1D e E), C6 simetria pode ser assumida. Assim, o modelo corresponde a uma estrutura semelhante a cone hexagonal com um canal central, que aparece parcialmente obstruída (SEC: Figura 1F; IEC: <strong> Figura 1G, sobreposição Figura 1H). Um exame dos modelos individuais antes de média mostra que esta obstrução é provável que seja um artefacto do processo de cálculo da média. Figura 1: análise de dados de SAXS e comparação de D5 323 -785 (Figura adaptada de referências 12 e 18). A) Esquema de estrutura do domínio de proteína D5 e D5 323-785. B) cromatograma off-line de troca iônica com a indicação dos três picos. curva de laranja: Absorvância a 280 nm (UA), a curva azul: percentagem de tampão B. As percentagens de tampão B no lado dos picos são indicadas. C) Online cromatograma de permuta iónica. tecla colorida como em B. Além disso, a intensidade medida é indicado em verde. A dispersão experimental curva de umND calculada curva do modelo obtido por SEC-D SAXS) e IEC e) Análise de dados de D5 323-785. Modelo F) Bead de D5 323-785 com base em dados da SEC e dados G) IEC. H) Sobreposição dos modelos da SEC e da IEC. Os painéis em F) para H) foram criados usando um software de visualização molecular 24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Parâmetros de coleta de dados Instrumento: ESRF BM29 Comprimento de onda (A) 0.99 q-range (-1) ,0032-,49 Sample-to-detector distância 2.864 m Tempo de exposição (seg) 1 por quadro intervalo de concentração n / D Temperatura (K) 293 detetor Pilatus 1M (Dectris) Flux (fótons / s) 1 × 10 12 Tamanho do feixe (2 uM) 700 × 700 Parâmetros estruturais para D5 323-785, SEC I 0 (cm-1) [a partir de Guinier] 0,0237 Rg (a) [a partir Guinier] 48 q min R g – q max R g usado para Guinier 0,77-1,24 D max (a) [a partir de P (R)] 145 Q-gama utilizada para P (r) (A-1) 0,02-0,17 Porod volume V P (A 3) [do Scatter] (570 ± 5) x 10 3 Massa molecular M r (kDa) [a partir de V P] 345 Calculado monomérica senhor da sequência (kDa) 321 Parâmetros estruturais para D5 323-785, IEC I 0 (cm-1) [a partir de Guinier] 0,386 Rg (a) [a partir Guinier] 46,5 ± 0,1 q min R g – q max R g usado para Guinier 0,44-1,29 D max (a) [a partir de P (R)] 120 Q-gama utilizada para P (r) (A-1) ,03-0,18 Porod volume V P (& #197; 3) [a partir de Dispersão] (577 ± 5) × 10 3 Massa molecular M r (kDa) [a partir de V P] 339 Calculado hexamérica senhor da sequência (kDa) 321 Tabela 1: parâmetros de dados de SAXS. A tabela resume os parâmetros de aquisição de dados e análise de SAXS.

Discussion

Para muitas macromoléculas, uma etapa final de purificação utilizando cromatografia é necessária antes da coleta de dados de SAXS para obter um bom conjunto de dados de qualidade. No entanto, nem todas as amostras permanecem estáveis; eles podem ser propensos a agregação ou re-equilibração a uma mistura de estados de oligomerização. Portanto, um passo de purificação final online na linha de luz é necessária para minimizar o tempo entre a purificação e a recolha de dados, a fim de obter os dados de SAXS melhor qualidade. Dependendo das propriedades biofísicas da proteína de interesse, sec-SAXS ou IEC-SAXS podem ser escolhidos para se obter a qualidade da amostra óptima. Aqui, sobre uma construção de proteína derivada da helicase / primase D5, ambas as técnicas são explicadas e discutido.

Aquisição de dados SEC-SAXS está se tornando mais e mais padronizados e está disponível em muitas linhas de luz BioSAXS. A análise dos dados, especialmente subtração de fundo, é relativamente simples e fácil. No entanto, um sinal de tampão estávele a separação suficiente das espécies macromoleculares continua a ser essencial. Portanto, é crítico para reservar tempo suficiente para equilibrar a coluna exaustivamente. A falha deste método pode ser devido a contaminantes persistentes de tamanho semelhante para a proteína de interesse, em baixas concentrações, e tampões sensíveis à radiação.

Na prática, inicialmente, sec-SAXS é susceptível de ser usado como o método de escolha para a maioria das amostras macromoleculares. Ainda assim, muitos protocolos de purificação requer um passo de prévia IEC devido à presença de contaminantes ou de agregação. Dado que a cada passo de concentração e cromatografia está associada a perdas de amostra (estimado em 30-50%) e no tempo, directa IEC-SAXS é vantajosa. Para amostras que não pode ser purificado por SEC, seja devido à presença de "contaminantes" de tamanho similar ou porque severamente agregado nas concentrações necessárias, IEC-SAXS seria sempre a melhor abordagem adequada. Além disso, as taxas de fluxo mais elevadas suportadopor muitos colunas IEC pode ajudar a reduzir o tempo de trânsito entre a purificação e de medição. No exemplo aqui apresentado, IEC foi usado com uma eluição de passo, que permite a separação dos picos próximos de 323-785 D5 de contaminantes, escolhendo cuidadosamente os passos de concentração de sal. Em princípio, o número de passos é ilimitado, mas na prática, é necessário pelo menos um passo de pico por, e não são muitas deve ser escolhido. Para o método de subtracção do fundo descrito acima, é fundamental para medir um número relativamente elevado de composições tampão diferentes a fim de encontrar a uma correspondência.

A desvantagem compartilhada de ambas as técnicas é a falta de informações precisas concentração de proteína. Devido a isso, a determinação da massa precisa baseado em dispersão para a frente não é possível. Para as proteínas globulares, tais como D5 323-785, o volume Porod fornece uma alternativa, se bem que menos precisa estimativa, em massa, mas para proteínas altamente flexíveis ou desordenados, Esta abordagem não seria válido.

Uma variação do gradiente passo a passo método IEC-SAXS aqui apresentada é a utilização de um gradiente linear em vez disso. Embora seja possível trabalhar com o maior número de passos, como desejado para isolar sub-picos utilizando uma eluição por passos, na abordagem gradiente linear, que é necessária para optimizar as condições de gradiente com cuidado, a fim de separar os picos inteiramente antes de iniciar o SAXS experimentar. A subtração nesta abordagem poderia ser feito frame-sábio e poderia ser verificada por meio da comparação dos quadros individuais, mas requer a manipulação de dados mais avançada e um software dedicado ainda não existe.

A escolha de uma coluna adequada é crítica para ambas as técnicas, uma vez que determina a separação das espécies macromoleculares. colunas de exclusão de tamanho diferem na capacidade de carga, a gama de tamanho das macromoléculas separáveis, e resolução, enquanto que as colunas de permuta de iões pode variar com o tipo e a densidadede suas cargas imobilizadas.

Embora o protocolo aqui apresentado é específico para a linha de luz ESRF BM29, a adaptação a qualquer outra linha de luz SAXS é, em princípio, simples. Os principais requisitos são um fluxo suficientemente elevado de raios-X e um detector adequado (de preferência um único fotão de contagem), para adquirir dados razoáveis ​​de sinal-para-ruído na gama de segundos ou menos, e um sistema de cromatografia líquida de linha capaz de criar gradientes. A aplicação exacta seria, naturalmente, dependem do ambiente de linha de luz local.

Os resultados obtidos na D5 323-785 usando os dois métodos diferem ligeiramente. O raio de rotação é um pouco menor para os dados IEC do que para os dados de SEC, e os mínimos locais da curva de espalhamento são transferidas para vectores de dispersão um pouco maiores. Isto significa que a D5 323-785 medido com a IEC-SAXS é ligeiramente mais compacta do que a D5 323-785 medido com SEC-SAXS. Isto pode be, devido a diferenças na preparação da amostra, no tempo entre a purificação e medição (IEC é mais rápido), ou, menos provável, a um contaminante na amostra SEC-purificado. Os modelos de talão obtidos de forma totalmente independente, com ambos os métodos são comparáveis (Figura 1H). D5 323-785 mostra o, a estrutura hexamérica oca esperado 18.

Em conclusão, permuta iónica e cromatografia em linha de exclusão de tamanho em linha são importantes os métodos de purificação bioquímicas que pode ser acoplado directamente ao 6,7,9-12,25,26 SAXS. A subtração de dados IEC-SAXS fundo é um pouco mais difícil e ambíguo do que para SEC-SAXS, mas não deixa de ser possível. Dependendo das propriedades biofísicas da proteína de interesse, tanto SEC e IEC-SAXS permitiria a optimização da separação das espécies com as vantagens inerentes. Fornecendo inteligência que os passos de validação (como descrito) estão correctamente observado, os dados resultantes podem ser analisadosh confiança, e os modelos podem ser determinados utilizando as ferramentas padrão disponíveis na comunidade. Em conjunto, ambas as técnicas de separação em linha para permitir que uma ampla gama de macromoléculas biológicas, obtendo-se os dados não acessíveis através de medições estáticas convencionais.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Santé des Armées and the Délégation Générale pour l’Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

Materials

1,4 dithiothreitol [DTT] Euromedex EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel Biorad 4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix ThermoFisher scientific F 548
acetic acid glacial VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20104.298
Agarose D-5 Euromedex LF45130653
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K Millipore Ltd UFC903024
Ampicillin sodium salt Euromedex EU0400-D
Benzonase Novagene 70750-3
bromophenol blue  MERCK 8122
Complete protease inhibitor cocktail  Roche 11231400
Econo-Pac 10 DG Desalting column Bio-rad 732-2010
EDTA Sigma E-5134
Glycerol VWR Chemicals (BDH Prolabo) 24388.295
Glycine Euromedex 26-128-6405-C
HindIII Roche 656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel Sigma H0537
Hydrochloric acid (HCl) VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20252.295
Imidazole AppliChem Panreac A1073,0500
InstantBlue Expedeon ISB1L
LB broth Miller Fluka Analytical L3152
MgCl2 ICN Biomedicals Inc. 191421
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
NcoI Fermentas ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)  ThermoFisher scientific C6010-03
pProEx HTb vector  Addgene 10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106
QIAquick Gel extraction kit QIAGEN 28706
QIAquick PCR purification kid QIAGEN 28106
SDS  Sigma 75746
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen life technology S33102
T4 ligase ThermoFisher scientific EL0011
TEV home made
TOP 10 Invitrogen life technology C404003 
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Uno Q 1R column  Bio-rad 720 0011
β-mercaptoethanol MPBiomedicals, LLC 194834
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
Camserver software Dectris n.a. detector control software
DAMAVER ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to align ab initio models 
DAMMIF ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html ab initio  model reconstruction programm
HPLC program Biologic Duo Flow Bio-rad
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program, which performs the manipulation with experimental SAXS
PyMOL DeLano Scientific LLC https://www.pymol.org/ software for visualization.
SUPCOMB ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to superimpose 3D structures
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow Biorad
BioLogic Biofrac Fraction collector Biorad
HPLC system Shimadzu
Labsonic P Sartorius Stedim biotech BBI8535108
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References

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Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. J. Vis. Exp. (119), e54861, doi:10.3791/54861 (2017).
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