SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

1.オフラインの準備の説明とD5削除タンパク質のサンプルの生成注：D5 323から785構築物（ 図1A）をクローニングし、発現、および18に記載されているように精製しました。 pProEx HTBベクターに構築物を複製します 製造業者の助言以下5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 'および5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3'プライマーおよびポリメラーゼを用いたPCR反応混合物を、使用D5Rのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行います。 製造元の助言に従い、スピンカラムを介してPCR断片を精製します。 緩衝液組成及びインキュベーション時間に関する製造業者の推奨に従って、NcoIおよびHindIII制限酵素でPCR断片とプラスミドを消化。 0.5×TAE緩衝液（20mMのTris、10mMの酢酸、1％アガロースゲル上で断片を実行しますおよび0.5mM EDTA）およびDNA色素でゲルを染色します。 UV光にゲルを公開します。 注意：個人の安全装置を着用してください！メーカーの推奨に従って、消化したPCR断片のバンドと消化されたプラスミドを切り出し、ゲル精製スピンカラムキットを用いてDNAを精製。 製造業者の推奨に従って、迅速ライゲーションキットを用いてプラスミドに精製されたPCR断片を連結。 プラスミド増幅のために最適化されたコンピテント細菌への連結反応からの熱ショックを経て製品を変換します。 細菌のバイアルにライゲーション産物の半分を追加します。 20分間氷上で反応チューブをインキュベートします。 30秒間42℃でチューブをインキュベートします。 2分間氷上にチューブを置きます。 抗生物質を含まないルリア・ベルターニ（LB）ブロス（ミラー）の1 mLを加え、細胞を1時間、37℃で回復しましょう。 16,100×gでのfoで細胞をスピンダウンR卓上マイクロチューブ遠心機で3秒と媒体の大部分を除去。 アンピシリン（50μgの/ mLの最終）を含むLB寒天プレート上に細胞を広げ、コロニーを37℃で一晩成長させ。 アンピシリン（50μgの/ mLの最終）とLBの3 mLの中にコロニーを入れ、一晩160 rpmで振とうしながら、37℃で培養物を成長させます。 プラスミドを抽出するためのミニプレップキットの指示に従ってください。 配列決定のためのプラスミドのサンプルを送信し、変異の不在のため、正しい挿入するためのシーケンスを分析します。 pProEx HTB D5 323から785は、タンパク質発現のために最適化された細菌に構築（1μLを使用して、ステップ1.1.7の手順に従ってください）変換します。アンピシリン（50μgの/ mLの最終）を含むLB寒天プレート上に細菌を広げます。 出発培養物を作成するには、アンピシリン（50μg/ mlの決勝）でLB 300mLに1つのコロニーを入れて、160 Rで振盪し、37℃で細菌を育てます午後一晩。 OD 600 = 0.3に達するまで、アンピシリンの存在下でのLBの12×1 L（最終を50μg/ mL）を、37℃でpProEx HTB D5 323から785菌スターターカルチャー20mLの各を接種します。 18℃まで温度を低下させ、1mMのIPTGでOD 600 = 0.5で発現を誘導します。 160 rpmで、18°Cで一晩、それらを振って、文化をインキュベートします。 30分間50,000×gで、4℃での遠心分離によって細菌を回収。 （50mMのトリス-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、5mMのMgCl 2、10mMのβメルカプトエタノール、および10％グリセロール）1×プロテアーゼ阻害剤と、25単位（溶解緩衝液約150mLに細菌ペレットを再懸濁U）/ 10mLのDNアーゼ。溶解氷上で超音波処理を介した細菌（1インチプローブ、50％のパワー、0.5秒パルス、0.5秒休止、3×5分）。 ニッケル親和性カラム（ニッケルカラム、1.5 mLのベッドボリューム）上に上清をロードし、Bの10カラム容量（CV）でそれを洗浄します緩衝液（50mMのTris-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、10mMのβメルカプトエタノール、および10％グリセロール）、洗浄緩衝液（50mMのTris-HCl [pHが7]、1MのNaCl、10のCVをinding mMのβメルカプトエタノール、および10％グリセロール）、およびイミダゾール洗浄（50mMのトリス-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、10mMのβメルカプトエタノール、10％グリセロール、30 mMイミダゾール）の10 CV。 D5 323から785（20mMのトリス-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、10mMのβメルカプトエタノール、10％グリセロール、及び200mMイミダゾール）を溶出します。 ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） – ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を介して別の精製工程を点検します。 （4％SDS、20％グリセロール、120mMのトリス-HCl [pH6.8の]、および青色0.02％重量/体積ブロモフェノール2×）10上の各精製工程のフロースルー混合1Xローディング色素との負荷2-20μL ％SDSゲルおよびバッファー（25 mMトリス、0.192 Mグリシン、および0.1％SDS）を実行して1×レムリで200 Vでそれらを実行します。 すぐに使用できるクマシーブルー溶液でゲルを染色します。 EXCハンゲ、製造元のマニュアルに従って脱塩カラムを用いて、結合緩衝液で溶出したタンパク質のバッファー。 タンパク質溶液にタバコエッチウイルス核封入、エンドペプチダーゼ （TEV、タンパク質1ミリグラム/ 100 mg）を添加することによって、Hisタグを切断します。室温で一晩インキュベートします。 SDS-PAGEを行うことにより、消化をチェックする（ステップ1.5を参照してください） 結合緩衝液中のNi-カラムを平衡化します。タンパク質溶液を通過させるフロースルーを収集しながらイミダゾール洗浄バッファー2 CVでビーズを洗浄します。 0.5 mLの最終体積に遠心濃縮器を用いてタンパク質を濃縮します。 ゲル濾過緩衝液で平衡化したサイズ排除カラム上に濃縮されたタンパク質を注入（20mMのトリス-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、10％グリセロール、及び1mMジチオスレイトール[DTT]）。 フロースルー0.5-mL画分中を収集します。 によって、ピークサンプル中のタンパク質の存在および純度を確認しますSDS-PAGEを行う（ステップ1.5を参照してください）。 D5 323から785の溶出ピークの画分を兼ね備えています。一定のトリスとDTTの濃度を維持しながら、20mMのトリス-HCl中のタンパク質溶液5mL [pHが7]、150mMのNaCl、10％グリセロール、及び1mM DTTため（25mMのNaCl及び5％グリセロールにサンプルを希釈します最初の20mMのTris-HCl 5mLの[pHが7]および1mM DTTを追加し、20mMのトリス-HCl [pHが7]、5％グリセロール、及び1mM DTT）の20 mLを加え。 イオン交換カラムにサンプルをロードします。バッファ使用（20mMトリス[pHが7]、25 mMの塩化ナトリウム、5％グリセロール、及び1mM DTT）及び緩衝液B（20mMトリス[pHが7]、1 MのNaCl、5％グリセロール、及び1mM DTT） 1 Mに25ミリモルの塩勾配を形成します 1.5-mL画分に溶出したタンパク質を収集します。 （ステップ1.5および図1Bを参照）SDS-PAGEを行うことにより、ピークサンプル中のタンパク質の存在および純度を確認します 0.5 mLの最終体積に遠心濃縮器中のタンパク質溶液を再濃縮。 Rerunは、ゲル濾過緩衝液中のサイズ排除カラムで濃縮されたタンパク質（20mMのトリス-HCl [pHが7]、150mMのNaCl、5％グリセロール、及び1mM DTTは、ステップ1.11参照します）。 2.データ収集注：可能な限り早期にビームタイムを要求します。 ESRFのために、利用可能なアクセスタイプにして、アプリケーションを提出する方法のガイドラインで発見することができます： http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying 。実験のための提案と招待の受諾した後、すべての参加者は、安全教育を完了する必要があります。訓練の検証の後、サンプルに必要な安全性情報と共に、実験のためにビームラインを客員研究員を宣言する（ESRFユーザポータルを介して）「A型」に記入。実験を議論するために地元の担当者にお問い合わせください。 SEC-SAXSデータ収集 注：ONLについてINEの精製は、BM29に設置高速液体クロマトグラフィー（HPLC）システムを使用します。システムは、インライン脱気装置、バイナリーポンプ、バッファ選択やグラデーション、オートサンプラー、UV-VISアレイphotospectrometer、および伝導度のためのバルブで構成されています。これは、直接SAXS露光ユニット19のフロースルー毛細管に装着されています。 脇ゲルろ過緩衝液1mlを入れてください。 SECシステムにバッファボトルを接続します（デフォルトはポートAです）。 使用中の列に応じて流量を選択してください。注：ここで使用されるサイズ排除カラムは、流速は0.1ミリリットル/分です。カラムの最大圧力を定義し、背圧のノートを取り、少なくとも1.2 CVに取得時間を設定します。 「自動パージ」機能を経由してポンプと上流管をフラッシュします。 システムは緩衝液で満たされるまで待ってから、カラムを接続します。少なくとも1.5 CVを通過させることにより、カラムを平衡化します。 インターロックハッチと放射線損傷に起因する信号の変動を制御するために、サンプルチェンジャーを使用して、ステップ2.1.1に確保されたバッファを測定します。バッファへの放射線損傷がない場合にのみ継続。 HPLCモードにビームラインの制御システムを切り替えます。フレームあたり1秒で200フレームを収集し、バッファのテストランを行います。加算された強度プロットに検出器によって与えられたカウント数を書き留めます。 注：信号は、以前に測定されたバッファと一致する必要がありますし、時間をかけて加算された強度は一定のままであるべきです。信号が一致しないか、または一定でない場合、システムのより長い平衡化が必要とされます。 少なくとも10分間、卓上マイクロチューブ遠心機で13,000×gでサンプルをスピンダウン。 （提供）HPLC互換のガラスバイアルに試料を充填し、自動注入器に入れて。井戸の位置に注意してください。 ユーザーの安全に関する研修で説明したように、標準的な手順を使用して実験ハッチを連動。 ログインし、ビームライン制御ソフトウェアを介してデータ保存用のフォルダを作成します。 プログラム「クイックバッチ」機能を使用してHPLCシステム。ステップ2.1.10で作成したフォルダにUVデータを保存する場所を設定します。同じフォルダにASCIIファイルを格納し、UVデータの自動ASCII変換を活性化することを確認します。 注入量とよく位置を選択します。 「スタート」ボタンを押して、キューに測定を追加します。ソフトウェアは、バッチを保存するように要求されます。保存のための準備が、これは自動的に測定を開始するように、「保存」ボタンを押さないでください。 ビームライン制御ソフトウェアのデータ収集パラメータを設定します。総データ収集時間は、ステップ2.1.2で定義された取得時間のわずかに過剰であるようにフレーム数を選択します。 安全シャッターを開き、ビームライン制御ソフトウェアを使用して、SAXSデータ収集を開始。データがCORであることを確認しますrectly取得しました。ステップ2.1.6で収集したデータに新たに収集したデータを比較し、加算された強度のカウント数は、少なくとも100フレームのために一定のままであり、ステップ2.1.6からの値と一致していることを確認してください。 SECは、ステップ2.1.11で調製し、「保存」ボタンを押すことで実行開始し、注入が完了し、UVデータ収集が開始されたときにcamserverソフトウェアに表示されているフレーム番号をメモします。 データ収集後、オープンで「データ収集」タブをISPyBデータベース20を開き、データセットと自動解析21の結果にアクセスするには、「戻る」ボタンを押してください。 IEC-SAXSデータ収集 注：代わりに、一般IEC実験に適用され、連続線形勾配は、バッファBの量が予め設定された離散的なステップで増加させる段階的勾配を用います。 samplためのHPLCプログラムを作成します。電子空きバッファラン。プログラム段階的勾配0％緩衝液Bから開始し、バッファBが100％に達するまで、2 CV後に5％ポイント増加します。 脇各バッファの一部を入れてください。ポートAへの低塩緩衝液AとポートBへの高塩緩衝液Bで1とボトルを接続します流量を選択し、列（この例では、1mL /分）の圧力限界以下とどまります。 ステップ2.1.3のように、「自動パージ」機能を使って、ポンプや上流のチューブをフラッシュします。 低塩緩衝液A中でシステムを平衡化する（ステップ1.15参照）、イオン交換カラムを接続します。カラムは完全に（少なくとも1.5 CV）を平衡化されるまで待ちます。 ステップ2.1.5のように、サンプルチェンジャーを使用して、放射線損傷のための緩衝液A及びBを調べるために、ステップ2.2.2で確保されたバッファを使用してください。 ステップ2.1.6のように、カラムから出てくるバッファを確認してください。ステップ2.2.6で記録された緩衝液Aの信号に信号を比較してください。再び注意加算された強度プロット内のカウント数。 バッファの実行のためのデータ保存用のフォルダを作成します。 HPLCシステムモードでデータ収集を設定します。総データ収集時間は、IECの実行の合計時間を超えているように、フレーム数を選択する（ステップ2.2.1を参照）。 安全シャッターを開き、SAXSデータ収集を開始。それが正しく進行していることを確認して、加算された強度は、少なくとも100フレームのためのステップ2.2.7で述べた値で一定のままであることを再確認してください。 HPLCソフトウェアの「単一ファイル名を指定して実行」機能を使用し、ステップ2.2.1でプログラム段階的勾配を開始します。注射のために、この段階で何のサンプルを注入しないために、-1にバイアル番号を設定します。プログラムが起動すると、取得したフレーム数を書き留めます。 サンプル実行のためのHPLCプログラムを作成します。プログラムステップ1.1.5でオフライン測定バッファB.見積もりの​​0％から各ピークのバッファBの割合を開始する段階的勾配（ <strオング>図1B）。正確に1％ポイント以下と1.5ポイント関心のピークより少なくとも3段階、2.5 CV（ 図1C）のためにそれぞれ設定します。 2.5 CVのための100％緩衝液Bでの最終ステップを追加します。 少なくとも10分間、卓上マイクロチューブ遠心機で13,000×gでサンプルをスピンダウン。 20mMのトリス-HCl [pHが7]、10％グリセロール、及び1mMのDTTと混合することにより、バッファA（25mMの）の塩濃度に希釈D5 323から785。 カラムに手動でサンプルをロードします。気泡の形成を回避するために、ポンプを一時停止した後、希釈した試料中にバッファに入力されたチューブを入れてください。直接フロースルーカラムからを収集するために、検出器からカラムを取り外します。 試料容器がほぼ空になると、バッファA（チューブを移動させながら、再びポンプを一時停止）に入力されたチューブを返し、カラムにチューブからサンプルを転送するために緩衝液Aでポンプを再起動します。全サンプルは、一旦ロードされ、緩衝液Aの2 CVを通過し、その後、検出器にカラムを再接続します。 サンプル実行のために、データ保存用のフォルダを作成します。 安全シャッターを開き、SAXSデータ収集を開始。データ収集が正常に進行していることを確認して、加算された強度は、少なくとも100フレームのためのステップ2.2.7で述べた値で一定のままであることを再確認してください。 ステップ2.2.12でプログラム段階的勾配を開始するために、HPLCソフトウェアの「単一ファイル名を指定して実行」機能を使用します。注射のために、この段階で何のサンプルを注入しないために、-1にバイアル番号を設定します。プログラムが起動すると、取得したフレーム数を書き留めます。 オープンISPyB 20の「データ収集」を押して、データセットと自動分析21を見て「行きます」。 「ポストラン解析」ソフトウェアを使用してASCII形式にHPLCシステムからのUVデータをエクスポートします。 3。SEC-SAXSデータ削減と解析 「移動」ボタンを押すことによりISPyBにおけるデータ収集中のデータを開きます。 SAXSデータ収集のフレームは溶出ピークに対応概要で決定します。回転半径がピークを通して安定であることを確認します。 自動化されたバッファの補正が正しく行われたことを確認してください。実験SAXSデータファイル22で操作を行い、それらを平均化プログラムにピークの中心部からロードフレーム。その後、自動的に生成されたバッファのファイルをロードし、平均フレームの高Q領域とバッファフレームが一致するかどうかを確認してください。 CORMAPテスト23を使用して定量的にピークを通して取得したフレームを比較してください。 関心領域をカバーするフレームが自動的に作成減算（* _sub.datファイル）をロードします。 「スケール」ボタンを押すことによって、相互にそれらをスケール。 比較例「データの比較」機能を使用して電子。ピーク全体でフレーム間には系統的な変化があってはなりません。 、関心のあるすべての* -_ sub.datフレームを開き、「マージ」ボタンを使用して、それらをマージし、.datファイルの形式でマージされたファイルを保存します。 低解像度でのデータの後のトリミングのためのギニエ範囲内の最初のデータ点を指摘し、プログラム中の「半径旋回」ツールで回転半径を決定します。 プログラム中の「距離分布」ツールと対距離分布関数を決定し、gnom.out結果として得られるの.outファイルを保存します。 4. 第一原理モデル Unixマシンでは、対称性の制約を受けることなく40× アブイニシオモデルの再構築プログラムを実行します。新しいフォルダを作成し、そこにgnom.outファイルをコピーします。次のようにプログラムを実行します。 以下のための（（I = 1; iは= 40 <;私は++））; gnom.out -ms -p dammifp1_ $私dammif行います。 D1 同様に、2番目のフォルダ内の6回対称のための対称性制限のある第一原理モデルの再構築プログラムを実行します。 以下のための（（I = 1; iは= 40 <;私は++））; DO dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $私;終わりましたすべての第一原理モデルの再構築プログラムの出力ファイル（* -1.pdb）を合わせます。ステップ4.1および4.2からの2つのフォルダでは、damaver -a * -1.pdbを実行します。 すべてのモデル（damaver.pdb）の組合だけでなく、適切な分子可視化ソフトウェア26に正しいボリューム（damfilt.pdb）にフィルタモデルを開き、それらを比較。 テキストエディタでdamsel.logファイルを開きます。ファイルの一番下にある「参照」と記載されているモデルは、最も代表的なモデルです。 5. IEC-SAXSデータ削減、分析、およびモデル実験SAXSデータファイル22で操作を行うプログラムでは、負荷約50 SAXSは、それぞれの混合工程からフレームバッファラン、「AVERAGE」ボタンを押して、結果を保存します。 ISPyBを介して利用可能な自動処理結果に基づいて、実験のフレームは、タンパク質の溶出に対応し、旋回の（予備）半径がピーク全体で安定していることを確認している特定します。 実験SAXSデータファイル操作プログラム22にフレームをロードし、バッファフレーム（ステップ5.1を参照）のために行われるよう、それらを平均します。次に、ステップ5.1で生成されたバッファ・ファイルをロードし、ピークからの平均と一致するバッファを見つけるために、（4.2ナノメートル-1以上）高いQの領域を比較します。 注：ピークからの平均とバッファ間のオフセット体系があってはなりません。サンプル曲線は、2つのバッファカーブの間に入るように思われる場合は、平均値を算出することにより、それらの曲線を補間します。 ピーク画分の平均散乱曲線からベストマッチとして識別バッファを減算し、その結果subtrを保存ファイルを務めました。また、減算の誤差を推定するために、前後の混合工程から平均バッファ曲線を用いてサブトラクション曲線を作成します。 繰り返しは、ピークの左半分と右半分のために個別に5.3および5.4ステップと、ピーク全体で信号の安定性を確認するためにステップ5.4からのものと結果を比較します。 ステップ5.4から手順をすべての3つの減算の曲線3.5および3.6に従ってください。 すべての3つの減算の曲線の結果を比較してください。 注：引き算の誤差内で堅調結果だけを信頼することができます。 ステップ5.3で識別された最良の減算のためのステップ4.1と4.2のようにモデリングを行います。 モデルを整列させるために、最も代表的なものを識別するために、4.5にステップ4.3に従ってください。 結果の6.比較 SECの代表的なモデルで12の 3D構造を重畳するためのプログラムを実行し（ステップ4.5）AND IEC-SAXSデータ（ステップ5.9）P6の対称性を持つ：supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb 分子可視化ソフトにmodel_sec.pdbとmodel_iec-r.pdbをインポートします。 modelsec.pdbの.firファイルやスプレッドシートのmodeliec-r.pdbを開き、実験と計算された散乱曲線の2Dグラフを作成します。