Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации
Summary
Здесь мы опишем недавно разработанный вирус гепатита В (HBV) системы репортер контролировать ранние стадии жизненного цикла вируса гепатита. Эта упрощенная в пробирке системы поможет в скрининга агентов против HBV с использованием стратегии высокой пропускной способностью .
Abstract
Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.
Introduction
Хроническая инфекция с вирусом гепатита В (HBV) является одним из основных факторов риска развития хронических заболеваний печени 1. Хотя современные терапевтические стратегии основаны на нуклеотидных аналогов , которые ингибируют ВГВ функцию Pol и / или введение типа интерферона , который активирует иммунные реакции у инфицированных лиц, а также косвенно подавляя пролиферацию HBV посредством функций гена интерферона-стимулированной 2, эти процедуры не могут устранить HBV ДНК полностью 3. Кроме того, появление HBVs, устойчивых к анти-POL агентов вызывает беспокойство 4. Введение комбинированных анти-вирусных агентов, непосредственно ориентированных на различные этапы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или вирус гепатита С (HCV) жизненного цикла было показано, чтобы успешно подавлять или уничтожать вирус (ы). Подобно этой идее, развитие анти-HBV агента (агентов), которые действуют непосредственно на различных этапах HBV жизненного цикла имеет важное значение для создания будущих методов лечения HBV.
В общем, создание простой в пробирке системы культуры целевого вируса способствует развитию антивирусных агентов. Тем не менее, есть по крайней мере два препятствия для развития в пробирке систем культивирования для скрининга агентов против HBV. Первым из них является отсутствие удобной системы культивирования клеток в пробирке для HBV – инфекции / пролиферации. В отличие от других вирусов, таких как ВИЧ и ВГС, которые распространяются в установленных клеточных линий, что трудно культивировать HBV в пробирке из – за ограничений , в том числе экспериментальных узком диапазоне хозяина. Использование специфических систем клеточных культур , таких , как клеточной линии гепатомы человека HepaRG, который восприимчив к инфекции HBV, 5, 6, 7, были разработаны для преодоления этих проблем. Кроме того, PXB клетки, выделенные из урокиназы-тире активатор плазминогена трансгенный / SCID мышей , привитых первичных человеческих гепатоцитов (ФН), как было показано, быть восприимчивы к инфекции ВГВ и репликации 8. Однако уровни репликации HBV в HepaRG зависят от состояния клеточной дифференцировки после культуры, что может привести к несогласованным и невоспроизводимые результаты уровней инфекции / репликации HBV. PXB обычно используется для экспериментов инфекции HBV, но ограничивается его доступностью. Тетрациклин индуцибельная HBV линии экспрессии в клетках, HepAD38, также широко используется для изучения репликации HBV, но эта система позволяет только оценку после транскрипции , а не на этапе входа HBV – инфекции 9. В последнее время идентификация натрия таурохолат cotransporting полипептида (НПБТ) в качестве функционального рецептора для ВГВ позволило разработать системы 10 культуры переменная HBV. Действительно, выражение НПБТ в нечувствительных гепатокарциномы клетках, таких как HuH7 иHepG2 позволяет инфекции ВГВ 10 и , таким образом, выбор чувствительных клеточных линий HBV была расширена, решение многих экспериментальных ограничений. Вторая проблема заключается в отсутствии простой тест-системы для оценки HBV-инфекции и репликации. Оценка HBV-инфекции обычно проводится путем анализа ДНК HBV, РНК и белков. Тем не менее, количественное определение этих вирусных маркеров отнимает много времени, часто дорого и не всегда просто. Таким образом, разработка простой системы анализа, например, с использованием ген-репортер, возможно, преодолеть проблемы, связанные с системами ВГВ анализа.
Тем не менее, так как размер генома , которые могут быть упакованы в HBV капсида ограничено – менее 3,7 кб 11 – размер гена – репортера должен быть как можно короче. Кроме того, наличие нескольких цис-элементов, рассеянных по всему геному, которые необходимы для репликации вируса, ограничивает позиции, доступные для в высказанное гена-репортера в геном. Несколько сообщений пытались ввести чужеродные гены, в том числе ВИЧ-1 Tat, зеленый флуоресцентный белок, и DsRed, в геноме HBV 11, 12, 13. Тем не менее, эти рекомбинантные HBVs не являются полезными для скрининга HBV-инфекции / репликации, или для высокопроизводительного скрининга факторов, влияющих на HBV-инфекции / репликации. Это происходит главным образом из-за низкой производительности рекомбинантных вирусов и пониженной интенсивности экспрессии репортерного гена, вызванного неэффективного производства вируса.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы сконструировали репортер HBV с высоким выходом продукции вируса. Этот вирус очень чувствителен для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации HBV, от входа в транскрипции. Для достижения этой цели, NanoLuc (NL) был выбран в качестве гена-маркера, потому что это небольшой (171 аминокислот) инженерии люминесцентный репортеркласс = "Xref"> 14. Кроме того, NL примерно 150 раз ярче, чем светлячков или Renilla люциферазы, и реакция люминесцентный является АТФ-независимым, предполагая, что частота ложных хит будет низкой для высокопроизводительного скрининга. Эффективность производства рекомбинантного HBV составляет примерно 1/5 от родительского HBV, и похожи на уровни, представленных за предыдущие HBV рекомбинантных вирусов; Тем не менее, яркость NL преодолевает проблемы производительности вируса, поэтому он может быть использован для массового скрининга анти-HBV агентов.
Скрининг агентов против HBV с использованием первичных гепатоцитов, HepaRG, HepAD38 и НПБТ трансдуцированных гепатоцитов может быть полезным для скрининга агентов против HBV традиционным способом (ами). Тем не менее, система, описанная здесь, имеет различные преимущества, такие как простое управление, высокую чувствительность и низкая стоимость для скрининга. Эти преимущества являются подходящими для высокой пропускной способности анализов с целью разработки и выявления новых HBV агентов в терапевтических целях.
Protocol
Representative Results
Discussion
HBV геном имеет четыре основных открытых рамок считывания (ORF , ) , включая ядро, полимеразы, поверхностных и X ORF , (рисунок 1). Транскрипция из этих четырех HBV ORF , жестко регулируется четырьмя промоутеров: при регистрации precore / ядро промотора , содержащие энхансер II, S1 промотор, S2 пром…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.
Materials
| Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai tesque | 09367-34 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 100 mm/collagen-coated dish | Iwaki | 4020-010 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
| 0.5 mol/l-EDTA Solution | Nacalai tesque | 06894-14 | |
| Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
| Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter | Merck Millipore | SLHP033RS | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Collagen coated 96-well plate | Corning | NO3585 | |
| Passive Lysis 5xBuffer | Promega | E1941 | |
| GloMax 96 Microplate Luminometer | Promega | E6501 | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30403-55 | |
| Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV delta epsilon | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV/NL | – | – | Reference 15 |
| 50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
| Anti-Myc antibody | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | Japan Blood Products Organization | – | |
| IFN-β | Mochida Pharmaceutical | 14987224005413 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 |
References
- Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), 35-50 (2004).
- Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
- Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
- Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
- Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
- Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
- Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
- Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
- Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
- Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
- Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
- Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W., Knipe, D., Howley, P. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. , 2185-2221 (2013).
- Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
- Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
- Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
- Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
- Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).
