Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

A infecção crónica pelo vírus da hepatite B (HBV) é um fator de risco para doenças hepáticas crônicas ^1. Embora as estratégias terapêuticas correntes baseiam-se em análogos de nucleótidos que inibem a função de HBV pol e / ou a administração de interferão do tipo I que activa as respostas imunitárias em indivíduos infectados, bem como a proliferação de HBV indirectamente supressão através de funções de genes estimulados com interferão ^2, estes tratamentos não pode eliminar o HBV DNA completamente ^3. Além disso, o aparecimento de HBVs que são resistentes aos agentes anti-Pol é de preocupação ^4. A administração de agentes anti-virais que visam directamente combinadas as diferentes etapas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou ciclo de vida do virus da hepatite C (HCV), foi mostrado para suprimir ou erradicar o vírus (es) com êxito. Semelhante a esta ideia, o desenvolvimento de um agente anti-HBV (s) que actuam directamente sobre as diferentes fases do Hciclo de vida BV é importante para o estabelecimento de futuras terapias HBV.

Em geral, o estabelecimento de uma simples no sistema de cultura in vitro do vírus alvo facilita o desenvolvimento de agentes anti-vírus. No entanto, existem pelo menos duas barreiras ao desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro para rastrear agentes anti-HBV. O primeiro é a falta de um sistema in vitro de cultura de células conveniente para HBV infecção / proliferação. Ao contrário de outros vírus, tais como HIV e HCV, que são propagadas em linhas celulares estabelecidas, é difícil de cultivar in vitro de HBV devido a limitações experimentais, incluindo uma gama de hospedeiros estreita. A utilização de sistemas de cultura de células específicas, tais como a linha celular de hepatoma humano HepaRG, que é susceptível a infecção por HBV, ^{5, 6, 7} ter sido desenvolvido para superar estes problemas. Além disso, as células PXB, isoladas de uroquinase-type do ativador do plasminogênio transgênico / SCID inoculados com hepatócitos humanos primários (PHH), mostraram-se suscetíveis à infecção por HBV e replicação ^8. No entanto, os níveis de replicação de HBV em HepaRG são dependentes do estado de diferenciação celular após a cultura, o que pode causar resultados inconsistentes e reprodutíveis de níveis de infecção / replicação de HBV. PXB é comumente utilizado nas experiências de infecção por HBV, mas é limitado pela sua disponibilidade. A linha de células de expressão HBV inducible tetraciclina, HepAD38, também tem sido amplamente utilizado para estudar a replicação do VHB, mas este sistema só permite uma avaliação após a transcrição e não na etapa de entrada da infecção por HBV ^9. Recentemente, a identificação do polipéptido cotransporting taurocolato de sódio (NTCP) como um receptor funcional para VHB tem permitido o desenvolvimento de um sistema de cultura de HBV variável ^10. Na verdade, a expressão PNCT em células de hepatocarcinoma não sensíveis, tais como Huh7 eHepG2 permite a infecção por HBV ¹⁰ e assim, a escolha de linhas de células susceptíveis de HBV foi expandido, resolver muitas das limitações experimentais. O segundo problema é a falta de um sistema de ensaio simples para avaliar a infecção por HBV e replicação. A avaliação da infecção por HBV é geralmente realizada por meio da análise HBV DNA, RNA e proteínas. No entanto, a quantificação destes marcadores vírus é demorado, dispendioso e muitas vezes nem sempre simples. Por conseguinte, o desenvolvimento de um sistema de ensaio simples, tais como a utilização de um gene repórter, pode superar os problemas associados com sistemas de ensaio de HBV.

No entanto, porque o tamanho do genoma que pode ser empacotado numa cápside de HBV é limitado – menos de 3,7 kb ¹¹ – o tamanho de um gene repórter deverá ser tão curto quanto possível. Além disso, a presença de vários elementos cis espalhados ao longo do genoma, que são essenciais para a replicação virai, limita as posições disponíveis em serção do gene repórter no genoma. Vários relatórios têm tentado inserir genes estranhos, incluindo o HIV-1 Tat, proteína fluorescente verde, e DsRed, no genoma de HBV ^{11, 12, 13.} No entanto, estes HBVs recombinantes não são úteis para o rastreio da infecção por HBV / replicação, ou para o rastreio de alto rendimento de factores que afectam a infecção por HBV / replicação. Isto é principalmente devido à baixa produtividade de vírus recombinantes e a intensidade reduzida da expressão do gene repórter causada pela produção de vírus ineficiente.

Para superar estes problemas, foi construída uma VHB repórter com um elevado rendimento de produção de vírus. Este vírus é altamente sensível para monitorizar as fases iniciais do ciclo de replicação de HBV, a partir da entrada para a transcrição. Para alcançar este objectivo, NanoLuc (NL) foi escolhida como um gene marcador, porque ele é um pequeno (171 ácidos aminados) por engenharia repórter luminescenteclass = "xref"> 14. Além disso, a NL é aproximadamente 150 vezes mais brilhante do que de pirilampo ou de Renilla luciferase, e a reacção luminescente é independente de ATP, o que sugere que a taxa de acerto falsa será baixo para rastreio de alto rendimento. A eficiência de produção do HBV recombinante é de aproximadamente 1/5 do progenitor de HBV, e semelhante para os níveis relatados por vírus recombinantes de HBV anteriores; No entanto, o brilho da NL supera os problemas de produtividade de vírus para que ele possa ser utilizado para o rastreio em massa de agentes anti-HBV.

Rastreio de agentes anti-HBV, utilizando hepatócitos primários, HepaRG, HepAD38 e hepatócitos NTCP-transduzidas pode ser útil para o rastreio de agentes anti-HBV pelo método convencional (s). No entanto, o sistema descrito aqui tem várias vantagens, tais como manuseio simples, de alta sensibilidade e baixo custo para triagem. Estas vantagens são adequadas para ensaios de alto rendimento para identificar e desenvolver novos agentes de HBV para fins terapêuticos.