פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול
Summary
כאן אנו מתארים מערכת הכתב החדש שפותח הפטיטיס B וירוס (HBV) לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור החיים HBV. זה פשוט יותר במערכת במבחנה יסייע ההקרנה של תרופות אנטי-HBV משתמש באסטרטגיה תפוקה גבוהה.
Abstract
Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.
Introduction
זיהום כרוני בנגיף הפטיטיס B (HBV) מהווה גורם סיכון עיקרי למחלות כבדות כרונית 1. למרות אסטרטגיות טיפוליות נוכחיות מבוססות על אנלוגים נוקלאוטיד המעכבות פונקצית pol HBV ו / או הממשל של אינטרפרון מסוג I שמפעיל מערכת חיסונית אצל אנשים נגועים וכן בעקיפין התפשטות HBV דיכוי באמצעות פונקציות גן מגורה אינטרפרון 2, טיפולים אלה לא יכולים לחסל HBV DNA לחלוטין 3. יתר על כן, הופעתה של HBVs כי הם עמידים בפני סוכני-Pol אנטי היא דאגה 4. הממשל של תרופות אנטי-ויראליות בשילוב ישירות מיקוד השלבים השונים של וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) או הפטיטיס C וירוס מחזור החיים (HCV) הוצגה לדכא בהצלחה או למגר את הנגיף (es). דומה לרעיון זה, פיתוח חומר נוגד-HBV (ים) אשר פועל ישירות על השלבים השונים של Hמחזור החיים BV חשוב לביסוס טיפולים HBV בעתיד.
באופן כללי, הקמת פשוט במערכת התרבות חוץ גופית של הנגיף היעד מקל על הפיתוח של תרופות אנטי-וירוס. עם זאת, ישנם לפחות שני מחסומים לפיתוח מערכות תרבות במבחנה להקרין תרופות אנטי-HBV. הראשון הוא העדר מערכת תרבית תאים נוח במבחנה עבור זיהום HBV / התפשטות. שלא כמו וירוסים אחרים, כגון HIV HCV, אשר מופצים בשורות תאים הוקמו, קשה לטפח HBV במבחנה בשל מגבלות ניסוי כוללים מגוון מארח צר. השימוש במערכות תרבית תאים ספציפיות כגון שורת תאי hepatoma אדם HepaRG, שהוא רגיש לזיהום HBV, 5, 6, 7 פותחו כדי להתגבר על בעיות אלה. יתר על כן, תאי PXB, מבודדים מן-טאי האוריקינאזמהונדס activator plasminogen PE / עכברים SCID מחוסן עם hepatocyte אדם מן המעלה הראשונה (PHH), הוצגו להיות רגישים לזיהום HBV ושכפול 8. עם זאת, רמות שכפולות HBV ב HepaRG תלויות מדינת ההתמיינות אחרי התרבות, אשר יכול לגרום לתוצאות עקביות irreproducible של רמות HBV זיהום / שכפול. PXB משמש בדרך כלל ניסויי זיהום HBV אך מוגבל בגלל זמינותו. שורת תאי ביטוי HBV מושרה טטרציקלין, HepAD38, גם נעשתה שימוש נרחב ללמוד שכפול HBV, אבל מערכת זו מאפשרת רק הערכה לאחר שעתוק ולא צעד כניסת HBV זיהום 9. לאחרונה, זיהוי של פוליפפטיד cotransporting נתרן taurocholate (NTCP) כמו קולטן פונקציונלי עבור HBV אפשרה פיתוח של מערכת התרבות משתנה HBV 10. אכן, ביטוי NTCP בתאי hepatocarcinoma שאינם רגישים כגון Huh7 וHepG2 מאפשרת זיהום HBV 10 וכך, הבחירה של שורות תאים רגישים HBV הורחבה, לפתרון רב מהמגבלות ניסיון. הבעיה השנייה היא חוסר מערכת assay פשוט להעריך זיהום HBV ושכפול. הערכת זיהום HBV מתבצעת לרוב על ידי ניתוח HBV DNA, RNA וחלבונים. עם זאת, כימות של סמנים אלה של הווירוס הוא גוזל זמן, לעתים קרובות יקר ולא תמיד פשוט. לכן, הפיתוח של מערכת assay פשוטה, כגון שימוש גן כתב, אולי להתגבר על בעיות הקשורות במערכות assay HBV.
עם זאת, מכיוון שהגודל הגנום כי ניתן לארוז לתוך קפסיד HBV מוגבל – פחות מ -3.7 kb 11 – בגודל של גן כתב צריך להיות קצר ככל האפשר. יתר על כן, נוכחותם של אלמנטי ציס מרובים הפזורים לאורך הגנום, שחיוניים שכפול נגיפי, מגבילה את המשרות פנויות ב sertion של גן הכתב לתוך הגנום. כמה דיווחים ניסו להכניס גנים זרים, כולל HIV-1 טאט, חלבון פלואורסצנטי ירוק, DsRed, לתוך הגנום HBV 11, 12, 13. עם זאת, HBVs רקומביננטי אלה אינם יעילים לסינון HBV זיהום / שכפול, או להקרנת התפוקה הגבוהה של גורמים המשפיעים HBV זיהום / שכפול. זאת בעיקר בגלל הפריון הנמוך של וירוסים רקומביננטי והעוצמת המופחתים של ביטוי גני כתב הנגרם על ידי ייצור וירוס יעיל.
כדי להתגבר על בעיות אלה, בנינו HBV כתב עם תשואה גבוהה של ייצור וירוס. וירוס זה רגיש מאוד לניטור בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול HBV, מן הכניסה שעתוק. כדי להשיג זאת, NanoLuc (NL) נבחר גן סמן בגלל זה הוא (חומצות אמינו 171) קטנות מהונדסות כתב זורחclass = "Xref"> 14. יתר על כן, NL הוא כ 150-לקפל בהירים יותר גחלילית או בלוציפראז Renilla, והתגובה הזורחת היא ATP-עצמאית, דבר המצביעה על כך אחוזי הצלחת השווא יהיו נמוכים להקרנת תפוקה גבוהה. יעילות הייצור של HBV רקומביננטי הוא כ 1/5 של ההורה HBV, ובדומה לרמות דיווחו לאיתור וירוסים הקודם רקומביננטי HBV; עם זאת, את הבהירות של NL מתגברת בעיות פריון וירוס, כך שהוא יכול לשמש להקרנה ההמונית של תרופות אנטי-HBV.
הקרנת חומרים אנטי-HBV באמצעות hepatocytes העיקרי, HepaRG, HepAD38 ו hepatocytes-transduced NTCP יכול להיות שימושי לצורך ההקרנה של תרופות אנטי-HBV ידי השיטה המקובלת (ים). עם זאת, המערכת המתוארת כאן יש יתרונות שונים כגון טיפול פשוט, רגישות גבוהה, ועלות נמוכה להקרנה. יתרונות אלה מתאימים מבחני תפוקה גבוהים לפתח אילו חומרי HBV חדשים למטרות טיפוליות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגנום HBV יש ארבע מסגרות קריאה פתוחות עיקריות (ORFs) כולל הליבה, פולימראז, המשטח ו- X ORFs (איור 1). תמלול של ארבעה HBV ORFs מוסדר בחוזקה על ידי ארבעה יזמים: אמרגן precore / ליבה המכילים שפר שני, אמרגן S1, אמרגן האמרגן ו- X S2 המכיל משפר לי 18. תעתיקי 3.5 קילו ו 3.4 kb מתורגמ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.
Materials
| Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai tesque | 09367-34 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 100 mm/collagen-coated dish | Iwaki | 4020-010 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
| 0.5 mol/l-EDTA Solution | Nacalai tesque | 06894-14 | |
| Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
| Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter | Merck Millipore | SLHP033RS | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Collagen coated 96-well plate | Corning | NO3585 | |
| Passive Lysis 5xBuffer | Promega | E1941 | |
| GloMax 96 Microplate Luminometer | Promega | E6501 | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30403-55 | |
| Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV delta epsilon | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV/NL | – | – | Reference 15 |
| 50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
| Anti-Myc antibody | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | Japan Blood Products Organization | – | |
| IFN-β | Mochida Pharmaceutical | 14987224005413 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 |
References
- Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), 35-50 (2004).
- Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
- Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
- Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
- Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
- Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
- Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
- Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
- Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
- Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
- Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
- Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W., Knipe, D., Howley, P. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. , 2185-2221 (2013).
- Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
- Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
- Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
- Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
- Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).
