Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Chronische Infektion mit dem Hepatitis – B – Virus (HBV) ist ein wichtiger Risikofaktor für chronische Lebererkrankungen ^1. Obwohl die derzeitigen therapeutischen Strategien auf Nukleotid – Analoga basieren, die HBV – pol Funktion und / oder die Verabreichung von Typ – I – Interferon hemmen , die diese Behandlungen können HBV nicht beseitigen Immunantworten bei infizierten Personen sowie indirekt Unterdrückung der HBV – Proliferation durch, ² Funktionen Interferon-stimulierte Gen aktiviert DNA vollständig ^3. Die Entstehung von HBVs Darüber hinaus, die Mittel anti-pol resistent sind von Belang ist ^4. Die Verabreichung der kombinierten antiviralen Mitteln direkt die verschiedenen Schritte des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) oder Hepatitis-C-Virus (HCV) Lebenszyklus wurde Targeting gezeigt, erfolgreich zu unterdrücken oder den Virus (es) zu beseitigen. Ähnlich wie diese Idee, die Entwicklung von anti-HBV-Mittel (n), die direkt auf den verschiedenen Stufen des H handelnBV Lebenszyklus ist wichtig für die Zukunft HBV Therapien zu etablieren.

Im Allgemeinen erleichtert die Schaffung eines einfachen in vitro – Kultursystem des Zielvirus die Entwicklung von Antivirusmitteln. Es gibt jedoch mindestens zwei Hindernisse für die Entwicklung von in vitro Kultursystemen anti-HBV – Mittel zu screenen. Die erste ist das Fehlen einer geeigneten in vitro – Zellkultursystem für die HBV – Infektion / Proliferation. Im Gegensatz zu anderen Viren, wie HIV und HCV, die in etablierten Zelllinien vermehrt werden, ist es schwierig , HBV in vitro zu kultivieren , da der experimentellen Beschränkungen einschließlich einer engen Wirtsbereich. Die Verwendung von spezifischen Zellkultursystemen wie dem menschlichen Hepatom – Zelllinie HepaRG, die HBV – Infektion empfänglich ist, ^{5, 6, 7} wurden , um diese Probleme zu überwinden , entwickelt. Darüber hinaus PXB Zellen, isoliert von Urokinase-type – Plasminogen – Aktivator transgenen / SCID – Mäuse mit primären humanen Hepatozyten (PHH) geimpft wurden zu einer HBV – Infektion und Replikation ⁸ bis anfällig gezeigt. HBV-Replikationsniveaus in HepaRG sind jedoch abhängig von dem zellulären Differenzierungszustand nach der Kultur, die inkonsistente und nicht reproduzierbare Ergebnisse der HBV-Infektion / Replikation Niveaus führen kann. PXB wird häufig für HBV-Infektion Experimenten verwendet, sondern wird durch die Verfügbarkeit begrenzt. Ein Tetracyclin induzierbare Expressions HBV Zellinie HepAD38, wurde ebenfalls weit verbreitet HBV – Replikation zu untersuchen, aber dieses System erlaubt nur Auswertung nach der Transkription und nicht am Eingang Schritt des HBV – Infektion ^9. Vor kurzem hat die Identifizierung von Natriumtaurocholat cotransporting Polypeptid (NTCP) als funktioneller Rezeptor für HBV ¹⁰ die Entwicklung einer Variablen HBV Kultursystem erlaubt. Tatsächlich NTCP Expression in nicht-empfindlichen hepatocarcinoma Zellen wie Huh7 undHepG2 ermöglicht HBV – Infektion ¹⁰ und somit die Wahl der HBV empfänglichen Zelllinien expandiert wurde, sind viele der experimentellen Beschränkungen lösen. Das zweite Problem ist das Fehlen eines einfachen Testsystems HBV-Infektion und Replikation zu bewerten. Bewertung der HBV-Infektion wird in der Regel durch die Analyse von HBV-DNA, RNA und Proteinen durchgeführt. Allerdings Quantifizierung dieser Virusmarker ist zeitraubend, oft teuer und nicht immer einfach. Daher kann die Entwicklung eines einfachen Testsystems, wie beispielsweise ein Reporter-Gen verwendet, Probleme mit dem HBV-Assay-Systeme assoziiert überwinden.

Da jedoch die Genomgröße, die in einer HBV – Kapsid verpackt werden kann , ist begrenzt – weniger als 3,7 kb ¹¹ – die Größe eines Reportergens sollte so kurz wie möglich sein. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von mehreren cis-Elemente über das Genom verstreut sind, die für die virale Replikation essentiell sind, begrenzt die verfügbaren Positionen in Einsetzen des Reportergens in das Genom. Mehrere Berichte haben fremde Gene einzuführen versucht, einschließlich HIV-1 Tat, grün fluoreszierendes Protein und DsRed, in das HBV – Genom ^{11, 12, 13.} Jedoch sind diese rekombinanten HBVs nicht nützlich für das Screening von HBV-Infektion / Replikation, oder der Hochdurchsatz-Screening von Faktoren HBV-Infektion / Replikation zu beeinflussen. Dies ist vor allem wegen der geringen Produktivität von rekombinanten Viren und die reduzierte Intensität der Reportergenexpression durch ineffiziente Virusproduktion verursacht.

Um diese Probleme zu überwinden, bauten wir einen Reporter HBV mit einer hohen Ausbeute an Virusproduktion. Dieses Virus ist sehr empfindlich für die Überwachung der frühen Phasen des HBV-Replikationszyklus von der Eingabe auf die Transkription. Um dies zu erreichen, wurde NanoLuc (NL) als Marker-Gen ausgewählt, weil es eine kleine (171 Aminosäuren) wurde entwickelt, lumineszente reporterclass = "xref"> 14. Außerdem ist NL etwa 150-fach heller als firefly oder Renilla-Luciferase und die Lumineszenzreaktion ist ATP-unabhängig, was darauf hindeutet, dass die falsche Trefferrate niedrig sein wird für die Hochdurchsatz-Screening. Die Produktionseffizienz des rekombinanten HBV beträgt etwa 1/5 der Mutter HBV und ähnliche Ebenen für frühere HBV rekombinanten Viren berichtet; jedoch überwindet die Helligkeit NL Virus Produktivitätsprobleme, so dass es für das Massenscreening von anti-HBV-Mittel verwendet werden.

Screening von anti-HBV-Mittel unter Verwendung von primären Hepatozyten, HepaRG, HepAD38 und NTCP transduzierten Hepatozyten können für das Screening von anti-HBV-Mittel durch herkömmliche Verfahren (n) nützlich sein. Jedoch das hier beschriebene System hat verschiedene Vorteile, wie einfache Handhabung, hohe Empfindlichkeit und geringe Kosten für das Screening. Diese Vorteile sind für Hochdurchsatz-Assays zu entwickeln und neue HBV Mittel für therapeutische Zwecke zu identifizieren.