De alto rendimiento de aislamiento robótica asistida sensible a la temperatura del letal mutantes en<em> Chlamydomonas reinhardtii</em

1. Mutagénesis UV Preparar un lote de 100 – 200 placas de agar rectangulares con Tris-acetato-fosfato (TAP) 9,10 medianas. Preparar estos platos unos días antes y mantenerlos en el banco que se seque para garantizar la rápida absorción de las células suspendidas en los próximos pasos. Cultura Chlamydomonas células hasta 0,2 – 0,5 de densidad óptica (OD 750; ~ 2 días) en 100 ml de líquido bajo la luz TAP, a 25 ° C y agitación a 100 rpm. NOTA: mutagénesis UV se lleva a cabo de forma independiente en dos fondos genéticos: Mat- Higro r (confiere resistencia a la higromicina B) y Mat + Paro r (confiere resistencia a la paromomicina). la elección del antibiótico es arbitraria, siempre que los dos tipos de apareamiento tienen resistencias a fármacos complementarios. Disponibilidad de una muestra de cada uno de los cultivos con un microscopio para asegurar que las células son viables, sano (natación e intacto), y sin contaminación. NOTA: Los cultivos cubierta de hierbas "accidente" yperder viabilidad, apareciendo como "fantasmas" en la microscopía de contraste de fase. No mantenga culturas shaker va una vez que alcanzan la saturación. El fenómeno de "fantasma" es fácilmente detectable en el paso 1.3. Se diluye la cultura a 0.003 OD 750. Envolver el frasco con hoja de aluminio para asegurar la densidad homogénea, como la cepa es móvil y nada direccionalmente en respuesta a la luz. Ajuste la densidad de la suspensión basándose en la dosis UV previsto, por lo que la contabilidad de la muerte celular, a 200 – 600 colonias sobrevivientes se formarán en las placas (Figura 1). Véase la Tabla 1 para obtener información sobre los tiempos de exposición UV. Adjuntar un casete de tubo pequeño que se ajuste a un dispensador de líquido y llevar a cabo una serie de lavados para la esterilización, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para evitar la contaminación. El uso de un dispensador de líquido de 8 x 12, prescindir 4 x 96 gotas de 2 l cada una en placas rectangulares (Figura 1 </strong>). Toque suavemente en el borde de la placa para asegurar la fusión de todas las gotas en una hoja delgada de líquido e inmediatamente cubrir las placas para evitar la exposición a la luz. Para asegurar la dispersión celular muy sencillo, incluso, utilizar placas secas, como se mencionó anteriormente, de forma rápida y cubrir las placas para evitar que las células de la natación en respuesta a la luz. Mantener el nivel de las placas de cubierta y en la oscuridad hasta que se absorba todo el líquido. Colocar las placas bajo una lámpara UV germicida (30 vatios tubo germicida UV) durante períodos de tiempo determinados empíricamente para dar un rendimiento óptimo de los mutantes TS entre los supervivientes. Aquí, usar tiempos de 0,5 a 1,5 min a una distancia de 40 – 50 cm para dar lugar a 90 a 99,9% de destrucción. Los supervivientes contienen 100 – 1.000 mutaciones puntuales inducidos por UV, de los cuales ~ secuencias de codificación 10% de cambio. Con el fin de garantizar la máxima potencia de irradiación UV sin reversión debido a ADN dependiente de la luz reparar 11,12, el trabajo en la oscuridad a este paso e inmediatamente el paqueteplacas en una caja oscura después de la irradiación. Mantener las placas en la oscuridad durante 8 a 24 horas a temperatura ambiente. Colocar las placas en una incubadora a 21 ° con la iluminación para formar colonias. La formación de colonias tarda unos 10 días. Asegúrese de envolver las placas con bolsas de plástico y añadir papel absorbente en el interior de borrar hasta la condensación de líquido. ciclos de evaporación y condensación de lo contrario pueden proporcionar rutas de película líquida para los contaminantes entren en las placas. Cargar las placas en las pilas relevantes como fuentes para la recolección de la colonia robótico (Figura 2). Recoger colonias para 384-arrays en las placas rectangulares, y crecer a 21 ° C con iluminación (~ 1 semana). Condensar el 384-arrays en un 1.536-arrays (4: 1) usando un robot réplica-plating (Figura 3), y permitir que las placas de crecer durante ~ 3 días en el 21 ° C incubadora. Replicar los 1.536-arrays de dos placas de cada uno y colocar uno en la incubadora a 21 ° C (permisivatemperatura) y el otro en un 33 ° C incubadora (temperatura restrictiva). Después de 24 horas, replicar las placas de 33 ° C a una nueva serie de placas pre-calentado, y colocarlos en la incubadora a 33 °. NOTA: La razón de esto es que chapado secundaria mutantes ts letales puede en algunos casos se acumulan biomasa sustancial, incluso si las células son detenidos en el primer ciclo celular después de la siembra. La réplica secundaria elimina esta señal y aumenta en gran medida la sensibilidad. Fotografiar las placas con una cámara digital después de 3 días de crecimiento a 33 ° C y 5 días de crecimiento a 21 ° C. Mantener las placas en un marco fijo. Use una "rejilla-placa" marcado con nueve indicadores de alineación que se fotografía junto con las placas de cultivo (Figura 4). placas de cultivo de fotografía como alterna emparejados 21 ° 33 ° C (21/33) y C imágenes. NOTA: Los diferentes tiempos de incubación se utilizan para igualar el crecimiento ya que el tipo silvestre crece significativamentemás rápido a 33 ° C que a 21 ° C. 2. Identificación de candidatos mutantes ts: Primera pantalla Procesar las imágenes de planchas 21/33 emparejados con una costumbre Matlab software de análisis de imágenes para eliminar el fondo y para segmentar las imágenes en un 1.536-matriz. El programa determinará la biomasa detectado (intensidad total de píxeles) en cada posición (Figura 5). NOTA: El software (proporcionado en el SI junto con instrucciones) utilizarán la imagen Red-placa para determinar la ubicación de las células (entradas individuales) en un 1.536-array en la alineación de ampliación y la placa de utilizar y calcular la intensidad total de píxeles en cada celda . Estos valores para cada mutante se comparan entonces en contra de parámetros ajustables para determinar el crecimiento requerida a 21 ° C con respecto a un ts + estándar y el grado de sensibilidad a la temperatura, definida como: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), donde S es la señal (en píxelesintensidad después de la sustracción del fondo), Mut es un mutante individual, y "WT" es una colonia no sensible a la temperatura elegida al azar (cepa mutagenizada que tenía ts + fenotipo). El crecimiento a 21 ° C se define como S (Mut 21) / S (WT 21). En esta primera pantalla, aplicar criterios de selección relajado (que permiten un crecimiento relativamente bajo a 21 ° C y un grado relativamente bajo de sensibilidad a la temperatura) para mantener la falsa baja tasa negativa. Cargar la lista de colonias seleccionadas generadas por el software como un archivo de instrucciones para la única colonia de recoger la robótica (típicamente en una gama de 384). Preparar las placas de origen y de destino de acuerdo con las instrucciones de la robótica y recoger colonias a matriz (Figura 6). NOTA: los recolectores convencionales requieren un archivo de instrucciones de alguna forma, como de .csv, .txt, .xls o. Todos los recolectores tendrán la capacidad de ser archivo de guiado; diferentes formatos deberán ser menores de edición del código de MATLAB (código fuente proporcionado). </li> Colocar las placas de puntería en la incubadora a 21 ° C durante ~ 5 días para crecer un plato stock. 3. La identificación de mutantes ts: segunda pantalla Repita el paso 2.1 para volver a probar colonias escogidas. Típicamente 30 – 50% de las colonias se vuelva a probar ts como claras letales, para un rendimiento de 2% – 5% de TS letales relativa a las colonias supervivientes iniciales mutagénesis UV. Repita el paso 2.2 para recoger los ts letales seleccionados dos veces, pero con un archivo de instrucciones modificado diseñado para colonias de matriz en bloques de 100 colonias en placas rectangulares en un 384 densidad. Esto es para el examen microscópico conveniente en el siguiente paso. El formato de archivo de instrucciones se especifica en tiempo de ejecución por el código de MATLAB. Asegúrese de incluir varias colonias WT como un control y colocar las placas a 21 ° C durante ~ 5 días. 4. Determinación del fenotipo inicial Replicar las placas 100-bloques dispuestos en el paso 3.2 y colocarlos en el C 21 ° incuBator para ~ 2 días para obtener colonias recién crecientes. Replicar la nueva copia de las placas 100-bloque (4.1) a tres copias. Coloque una copia en la incubadora a 21 ° y una en el 33 ° C incubadora como controles. Coloque la tercera copia ( "screening placas") en una configuración de robótica, y encuentra las colonias con los pernos largos tocados con agua esterilizada. NOTA: Las células de Chlamydomonas clavado en agar robóticamente tienden a la tierra inicialmente como un lugar bastante densa de células, con pocas células individuales disponibles para la inspección microscópica. Para optimizar las colonias para la inspección microscópica, detectar las células transferidas inicialmente con una gota de agua (el volumen de agua trasvasada por los pasadores largos robóticos es ~ 100 nl). Esto da como resultado la dispersión de las células en un radio pequeño (~ 1 mm) sobre el centro pinning inicial, con muchas células individuales aisladas. Tomar microfotografías de una región de cada punto de las placas de detección a tiempo 0 (sin dejar sola, células indivisas) (La Figura 7) y colocar las placas a 33 ° C para la incubación. Determine la ubicación de la imagen por el control manual de la etapa de un microscopio de disección modificada tétrada fijada de manera que se detiene en el 4.5-mm de distancia de centro a centro de una matriz de 384 densidad. Retire las placas de detección de la incubadora a 33 ° y tomar microfotografías, como en el paso 4.4, a diferentes puntos de tiempo (10 h, 20 h, 48 h). Asegúrese de que la etapa, el soporte de la placa, y el controlador de fase son calibrados con precisión para obtener imágenes de las mismas células en cada punto de tiempo. Realizar adquisición fotomicrografía rápida (~ 10 min). Utilice la segunda copia en el 33 ° C incubadora para verificar el fenotipo ts y para asegurarse de que las fluctuaciones de temperatura durante la adquisición de imágenes no tienen ningún efecto importante sobre fenotipo ts. Analizar imágenes microscópicas y seleccionar para mutantes en base a los criterios deseados (Figura 8). Detectar el conjunto seleccionado final en una placa de agar-96 dispuestos. Asegúrese de que cadaplaca contiene mutantes del mismo tipo de apareamiento y la resistencia a los medicamentos. Para cada plato, incorporar las dos últimas columnas positivo (mutación consulta) y un control negativo (WT) para el ensayo de complementación. 5. Complementación y varillaje de la prueba de nuevos mutantes para "viajeros frecuentes" Transferir grandes cantidades de las colonias arrays al medio de gametos-inducción libre de nitrógeno 10 en microplacas de 96 pocillos (densidad de cada colonia debe estar alrededor de 0,2 OD). Se incuban las placas con luz (13 – lámparas de mercurio de 20 W) durante ~ 5 horas para permitir la gametogénesis. NOTA: Este paso puede llevarse a cabo ya sea con una configuración de robótica replicar o manualmente con un dispositivo de recubrimiento simple. Suspender las consultas con los tipos de apareamiento opuestos que albergan los casetes de resistencia alternativos en tubos con medio de gametos de inducción libre de nitrógeno 10 para la gametogénesis. Mezclar las muestras en una placa diana en una mixt apareamientovolumen ure de 20 l (Figura 9). Después de ~ 10 minutos bajo la luz, punto 5 l de cada pocillo dos veces: una vez en una placa TAP para las pruebas de vinculación y una vez con TAP + 5 M + Paro 9 M Higro para las pruebas de complementación. Se incuban las placas de articulación en la incubadora a 21 ° durante la noche, y luego envolverlos en papel de aluminio. Mantenerlos en la oscuridad durante 5 días para permitir la formación zygospore. Incubar las placas para análisis de complementación para ~ 10 días a la luz a 21 ° C. NOTA: Las cantidades de la droga están calibrados para permitir la supervivencia de los diploides doblemente heterocigóticos, pero aún son suficientes para eliminar los haploides de apareamiento. Estas cantidades fueron calibrados para las integraciones de casete de resistencia estándar que se utilizan en este proyecto específico; con nuevas integraciones, las dosis deben ser recalibrados. La mayor parte de la biomasa se verifica a ser diploides por citometría de flujo (Figura 9), aunque un nivel variable de haploides (probablemente de la meiosis y el crecimiento de doblemente resistentessegregantes) por lo general se observa también. Replicar las placas de complementación-prueba en dos ejemplares para la identificación fenotipo TS. Coloque una copia a 21 ° C y una copia en 33 ° C durante ~ 5 días. Colonias de prueba para el fenotipo TS, tal como se describe en la sección 2.1 (Figura 5). Las colonias que no se complementan con la consulta probablemente representan alelos del mismo gen como los de consulta (diploides hetero-alélicas de mutaciones en el mismo gen). Para las pruebas de vinculación, después del paso 5.4, cambiar las placas de nuevo a la luz para permitir la meiosis y el crecimiento de los segregantes haploides de ~ 7 días. Replicar las placas de ensayo de ligamiento a TAP + 10 mM y 10 mM Paro Higro para seleccionar progenie de doble resistente (se prevé que el 25% de la progenie haploide, ya que las cintas estén disociados) y se incuba a 21 ° C durante una semana. NOTA: Aumentar la dosis del fármaco para haploides doblemente resistentes. colonias de prueba para el fenotipo TS, como yon paso 2.1. NOTA: Se espera que un fenotipo TS (y observado) para los mutantes en el mismo grupo de complementación como la consulta. Además, un fenotipo TS en el ensayo de unión, por un mutante que complementa la consulta, puede reflejar apretado vinculación entre la consulta y la nueva mutación. Los mutantes que complementan las consultas probados son probables nuevos genes que entrarán en la tubería para la identificación bioinformático de la lesión causante, y en última instancia, para su posterior análisis fenotípico.