Высокопроизводительный роботизированная Изоляция термочувствительных Смертельное Мутанты в<em> Chlamydomonas reinhardtii</em

1. УФ-мутагенеза Подготовьте партию из 100 – 200 прямоугольных пластин агара с Трис-ацетатфосфатного (TAP) средних 9,10. Подготовьте эти пластины на несколько дней вперед и держать их на скамейку, чтобы высохнуть, чтобы обеспечить быстрое поглощение взвешенных клеток в следующих шагах. Культура СЫатуйотопаз клетки до 0,2 – 0,5 оптической плотности (OD 750; ~ 2 дней) в 100 мл жидкого TAP под действием света, при температуре 25 ° С и встряхивании при 100 оборотах в минуту. Примечание: УФ – мутагенеза осуществляется независимо друг от друга в двух генетических фонов: Матвеевич Hygro г (придает устойчивость к гигромицину B) и Мат + Паро г (придает устойчивость к Паромомицин). Антибиотик выбор произвольно, при условии, что два типа спаривания имеют дополнительные сопротивления наркотиков. Проверьте образец каждой из культур под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки являются жизнеспособными, здоровыми (плавание и нетронутыми), так и без загрязнения. Примечание: Переросшие культуры "аварии" итеряют жизнеспособность, появляются как "призраки" в фазово-контрастной микроскопии. Не держать шейкер культур происходит, как только они достигают насыщения. "Призрак" явление можно было легко обнаружить на этапе 1.3. Разбавляют культуры до 0,003 OD 750. Заверните бутылку с алюминиевой фольгой, чтобы обеспечить однородную плотность, так как штамм подвижна и проплывает направленно в ответ на свет. Регулировка плотности суспензии на основе планируемой дозы ультрафиолета, так что учет гибели клеток, 200 – 600 выживший колонии образуют на пластинах (рисунок 1). Таблицу 1 для получения информации о времени УФ – облучения. Прикрепите кассету малой трубы, которая подходит жидкий распылитель и выполнить серию промываний для стерилизации, в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы предотвратить загрязнение. Использование 8 х 12 дозатора жидкости, отказаться от 4 х 96 капель 2 мкл каждого на прямоугольных пластин (рис 1 </strong>). Нажмите слегка на краю пластины, чтобы обеспечить сращивание всех капель в тонкий лист жидкости и немедленно покрывал пластины для предотвращения воздействия света. Для того, чтобы обеспечить очень даже одного рассеивание клеток, используют сухие пластины, как упоминалось выше, и быстро покрывал пластины, чтобы предотвратить клетки от плавания в ответ на свет. Держите покрытые уровень тарелки и в темноте, пока вся жидкость не впитается. Место пластин под бактерицидной УФ-лампой (30 Вт бактерицидная УФ трубка) в течение периода времени, определенного опытным путем, чтобы дать оптимальный выход ts- мутантов среди выживших. При этом использовать времена 0,5 – 1,5 мин на расстоянии 40 – 50 см, чтобы привести к 90 – 99,9% убийств. Выжившие содержат 100 – 1000 УФ-индуцированных точечных мутаций, из которых 10% ~ изменения последовательности, кодирующие. Для того , чтобы обеспечить максимальную эффективность УФ – облучения с не реверсии в связи с светозависимое ДНК ремонт 11,12, работа в темноте на этом шаге и сразу упаковатьПланшеты в темном поле после облучения. Держите пластины в темноте в течение 8 – 24 ч при комнатной температуре. Поместите пластины в инкубаторе C 21 ° с подсветкой для образования колоний. Образование колоний занимает ~ 10 дней. Убедитесь в том, чтобы обернуть пластины с полиэтиленовыми пакетами и добавьте абсорбирующей бумаги внутрь, чтобы промокнуть до жидкого конденсата. Испарения и конденсации циклов в противном случае может обеспечить жидкие маршруты пленки для загрязняющих веществ для ввода пластин. Загрузите листы в соответствующих стеки в качестве источников для роботизированного сбора колонии (рис 2). Выберите колонии для 384-массивов на прямоугольных пластин, и выращивать их при температуре 21 ° C с подсветкой (~ 1 неделя). Конденсировать 384-массивы в 1536-массивов (4: 1) с использованием реплики-металлизированный робота (рисунок 3), и позволяют пластины расти в течение ~ 3 дней в 21 ° C инкубатора. Реплицируйте 1536-массивы двух пластин каждый и поместите один в 21 ° C инкубаторе (разрешительныйтемпература), а другой в 33 ° С инкубатор (ограничительными температуры а). После 24 ч, повторить пластины в 33 ° С до нового набора предварительно нагретом пластин, и поместите их в 33 ° C инкубатора. Примечание: Причиной этого вторичного покрытия является то, что т.с. летальные мутанты в некоторых случаях могут аккумулировать значительную биомассу, даже если клетки арестованы в первом клеточном цикле после посева. Вторичная реплика устраняет этот сигнал и значительно увеличивает чувствительность. Сфотографировать пластины с цифровой камерой следующим 3-х дней роста при 33 ° С и 5 дней роста при 21 ° С. Держа пластины в неподвижной системе координат. Используйте "сетку-пластину" с обозначением девяти показателей выравнивания , что фотографируется вместе с культурой пластин (рисунок 4). Фотограф культуральные планшеты в виде чередующихся в паре 21 ° C и 33 ° C (21/33) изображения. Примечание: Различные периоды инкубации используются для выравнивания роста, так как дикого типа значительно возрастаетбыстрее при 33 ° C, чем при 21 ° С. 2. Идентификация Т.С. мутантных кандидатов: Первый экран Процесс спаренные 21/33 пластины изображения с помощью пользовательского Matlab программного обеспечения для анализа изображений для устранения фона и приводит к сегментации изображений в 1536-массива. Программа определит обнаруженную биомассы (суммарная интенсивность пикселей) в каждой позиции (рисунок 5). Примечание: Программное обеспечение (при условии, в SI вместе с инструкциями) будет использовать сетки пластины изображение, чтобы определить расположение ячеек (отдельных записей) в в 1536-массиве на выравнивание увеличения и пластины, используемой и вычислить суммарную интенсивность пикселей в каждой ячейке , Эти значения для каждого мутанта, затем сравниваются с регулируемыми параметрами для определения требуемого роста при 21 ° С по отношению к Ts + стандартных и степень температурной чувствительности, определяется следующим образом: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Мут 21) / S (WT 21), где S является сигнал (пиксельсивность после вычитания фона), Мут является индивидуальным мутант, и "WT" является случайным образом выбирается без термочувствительных колонии (мутагенезу штамм, который имел Ts + фенотип). Рост при 21 ° С определяется как S (Mut 21) / S (WT 21). В этом первом экране, применить расслабленные критерии отбора (с учетом относительно низких темпов роста при 21 ° С и относительно низкую степень чувствительности к температуре), чтобы сохранить ложный отрицательный результат низкого курса. Загрузите список отобранных колоний, полученных с помощью программного обеспечения в качестве файла инструкции для одиночной колонии собирание робототехники (как правило, в 384-массив). Подготовьте пластины источника и цели в соответствии с инструкциями робототехники и выбрать колонии массива (рисунок 6). Примечание: Обычные сборщики требуют файл инструкции в каком-то формате, например, .csv, .txt или .xls. Все сборщики будут иметь возможность быть файл приводом; различных форматов потребуется незначительное редактирование кода MATLAB (исходный код прилагается). </li> Поместите мишень пластины в 21 ° C инкубаторе в течение ~ 5 дней, чтобы вырастить запаса пластины. 3. Определение тс Мутанты: Второй экран Повторите шаг 2.1 для повторного тестирования отобранных колоний. Как правило, 30 – 50% колоний будет повторное тестирование, как ясно тс леталей, для выхода 2% – 5% Т.С. леталей относительно первоначальных колоний выживающих УФ-мутагенеза. Повторите шаг 2,2 для выбора в два раза экранированными тс леталей, но с измененным файлом инструкции, предназначенная для колоний массива на блоки из 100 колоний на прямоугольных пластин при 384 плотности. Это для удобного микроскопического исследования на следующей стадии. Формат файла инструкции указывается во время выполнения кода MATLAB. Убедитесь в том, чтобы включить несколько колоний WT в качестве контроля и поместите пластины при температуре 21 ° С в течение ~ 5 дней. 4. Определение Первоначальное Фенотип Реплицируйте 100-блочные плиты выстроенных на шаге 3.2 и поместите их в 21 ° C INCUБатор для ~ 2 дней, чтобы получить свеже растущие колонии. Репликация свежую копию 100-блок пластин (4.1) в трех экземплярах. Положите одну копию в 21 ° C инкубатора и один в 33 ° C инкубаторе в качестве контрольной группы. Поместите третий экземпляр ( "экранирующих пластин") в роботизированной установки, а также обнаружить колонии с длинными штырьки прикоснулся стерилизованной водой. Примечание: СЫатуйотопаз клетки прижат к агара роботизированного, как правило, первоначально землю как довольно плотного пятна клеток, с небольшим количеством одиночных клеток, доступных для микроскопического обследования. Для оптимизации колонии для микроскопического осмотра, обнаружить первоначально переданные клетки с каплей воды (объем воды, переносимой роботизированных длинными штырями ~ 100 нл). Это приводит к дисперсии клеток в небольшом радиусе (~ 1 мм) о начальной пиннинга, с большим количеством изолированных одиночных клеток. Возьмите микрофотографии области каждого пятна из экранирующих пластин во время 0 (пока еще холост, неразделенные клетки) (На рисунке 7) и поместите пластины при температуре 33 ° С в течение инкубации. Определить местоположение изображения с помощью ручного управления стадии модифицированного тетрадный рассечение микроскопа, установленного, чтобы дать остановки в 4,5-мм Расстояние между центра до центра массива 384 плотности. Удалите скрининговые пластины от 33 ° C инкубаторе и принимать микрофотографии, как в шаге 4.4, при различных временных точках (10 ч, 20 ч, 48 ч). Убедитесь, что на сцену, держатель пластины и контроллер ступени точно откалиброван, чтобы получить изображения одних и тех же клеток в каждый момент времени. Выполните быстрое приобретение микрофотография (~ 10 мин). Используйте вторую копию в 33 ° C инкубатор для проверки фенотипа TS и убедиться в том, что колебания температуры во время получения изображения не имеют значительного влияния на Ts фенотип. Анализ микроскопических изображений и отбора мутантов на основе желаемых критериев (рисунок 8). Пятно окончательный выбранный набор в 96-доченной агаром. Убедитесь, что каждыйПластина содержит мутанты одного и того же типа спаривания и лекарственной устойчивости. Для каждой пластины, включают последние две колонки, положительный (мутации) запроса и контроль отрицательный (WT) для анализа комплементационной. 5. Комплементация и рычажный механизм тестирования новых мутантов "Частые Флайерз" Передача больших количеств выстроенных колоний к безазотистой гамет-индукционной среде 10 в 96-луночных микропланшетов (плотность каждой колонии должна быть около 0,2 OD). Инкубируйте пластин под действием света (13 – 20 Вт ртутной лампочки) в течение ~ 5 часов, чтобы позволить гаметогенез. Примечание: Этот шаг может быть проведена либо с реплицирующуюся роботизированной установки или вручную с помощью простого гальванического устройства. Приостановка запросов с противоположных типов спаривания , несущих альтернативные кассеты сопротивления в пробирки с безазотистой гамет-индукционной среде 10 для гаметогенеза. Смешайте образцы в целевой пластине в матовую MIXTОбъем Юр 20 мкл (рисунок 9). После ~ 10 мин под светом, SPOT 5 мкл из каждой лунки дважды: один раз на TAP пластине для тестирования сцепления и один раз на TAP + 5 мкМ Паро + 9 мкМ Hygro для тестирования комплементационной. Выдержите рычажной пластины в 21 ° C инкубаторе в течение ночи, а затем завернуть их в фольгу. Храните их в темноте в течение 5 дней, чтобы позволить образование зигоспора. Выдержите комплементационная-тестирования пластины для ~ 10 дней на свету при 21 ° C. Примечание: Суммы наркотиков откалиброваны, чтобы позволить выживание дважды гетерозиготных диплоидами, но они все еще достаточно, чтобы устранить сопрягаемые гаплоидов. Эти суммы были откалиброваны для стандартных кассет интеграций сопротивления, используемых в данном конкретном проекте; с новыми интеграций, дозы должны быть откалиброван. Большинство биомассы проверяется , чтобы быть Диплоиды методом проточной цитометрии (рисунок 9), хотя с переменным уровнем гаплоидов (вероятно , от мейоза и роста вдвойне устойчивысегреганты), как правило, наблюдается также. Репликация комплементации-тестирования пластин в двух экземплярах для ts- идентификации фенотипа. Положите одну копию при температуре 21 ° C и одну копию при температуре 33 ° С в течение ~ 5 дней. Контрольные колонии для ts- фенотип, как описано в разделе 2.1 (рисунок 5). Колонии, которые не дополняющие с запросом, вероятно, представляют собой аллели одного и того же гена, как запрос (диплоидами гетеро-аллельные мутации в том же гене). Для тестирования сцепления, следующим шагом 5.4, смещение пластин к свету, чтобы позволить мейоза и разрастание гаплоидных сегрегантов за ~ 7 дней. Повторные испытания сцепления пластины к TAP + 10 мкМ Паро и 10 мкМ Hygro, чтобы выбрать для двойных устойчивых потомств (согласно прогнозам, составит 25% от гаплоидного потомства, так как кассеты несвязанными) и инкубировать при температуре 21 ° С в течение недели. Примечание: Увеличение дозы препарата для вдвойне резистентных гаплоидов. Контрольные колонии для ts- фенотипа, как яп шаг 2.1. ПРИМЕЧАНИЕ: ts- фенотип ожидается (и наблюдается) для мутантов в той же группе комплементационной в качестве запроса. Кроме того, ts- фенотип в анализе связей, для мутантного, который дополняет запрос, может отражать тесную связь между запросом и новой мутации. Мутанты, которые дополняют проверенные запросы вероятные новые гены, которые войдут в трубопровод для биоинформатики идентификации поражения причинного, и в конечном счете для дальнейшего фенотипического анализа.