Alto Throughput Robotically Isolamento Assistida da temperatura sensível Lethal Mutantes em<em> Chlamydomonas reinhardtii</em

1. UV mutagênese Preparar um lote de 100 – 200 placas de agar rectangulares com Tris-Acetato-Fosfato (TAP) médias 9,10. Preparar estas placas a poucos dias e mantê-los no banco para secar a assegurar uma rápida absorção de as células em suspensão nos passos seguintes. Cultura Chlamydomonas células até 0,2-,5 densidade óptica (OD 750; ~ 2 dias) em 100 ml de TAP líquido sob luz, a 25 ° C e agitação a 100 rpm. NOTA: mutagénese UV é realizada de forma independente em duas origens genéticas: Mat- Hygro r (confere resistência à higromicina B) e Mat + Paro r (confere resistência a Paromomycin). escolha do antibiótico é arbitrário, desde que os dois tipos de acasalamento têm resistências aos medicamentos complementares. Verificar uma amostra de cada uma das culturas sob o microscópio para assegurar que as células são viáveis, saudável (natação e intacta), e sem contaminação. NOTA: culturas Overgrown "crash" eperder viabilidade, aparecendo como "fantasmas" em microscopia de contraste de fase. Não manter culturas shaker indo uma vez que atingem a saturação. O fenômeno "fantasma" é facilmente detectável no passo 1.3. Dilui-se a cultura a 0.003 OD 750. Enrole a garrafa com folha de alumínio para garantir a densidade homogênea, como a estirpe é móvel e nada direcionalmente em resposta à luz. Ajustar a densidade da suspensão com base na dose de UV prevista, de modo que representando a morte celular, a 200 – 600 colónias sobreviventes vai formar-se nas placas (Figura 1). Ver Tabela 1 para obter informações sobre os tempos de exposição UV. Anexar uma cassete de pequeno-tubo que se encaixa um dispensador de líquido e realizar uma série de lavagens para a esterilização, de acordo com as instruções do fabricante, para prevenir a contaminação. Utilizando um distribuidor de líquido de 8 x 12, 4 x 96 distribuir gotas de 2 ul de cada uma em placas rectangulares (Figura 1 </strong>). Toque levemente na borda da placa para assegurar a fusão de todas as gotas para formar uma folha fina de líquido imediatamente e cobrir as placas para evitar a exposição à luz. Para assegurar uma dispersão célula muito uniforme único, utilizar placas secas, como mencionado acima, e rapidamente cobrir as placas para impedir que as células de natação em resposta à luz. Manter o nível de placas cobertas e no escuro até que todo o líquido é absorvido. Colocar as placas sob uma lâmpada de UV germicida (30 watt lâmpada UV germicida) por períodos de tempo determinados empiricamente para se obter um rendimento óptimo de mutantes ts- entre os sobreviventes. Aqui, usar tempos de 0,5-1,5 minutos, a uma distância de 40 – 50 cm a resultar em 90 – 99,9% de morte. Sobreviventes contêm 100 – 1.000 mutações pontuais induzidos por UV, de que ~ sequências codificantes de 10% de mudança. A fim de assegurar a máxima potência de irradiação UV sem reversão devido ao DNA dependente da luz reparar 11,12, trabalho no escuro a este passo e imediatamente a embalarplacas em uma caixa escura após a irradiação. Manter as placas no escuro durante 8-24 h à temperatura ambiente. Colocar as placas em uma incubadora a 21 ° C com iluminação, para formar colónias. A formação de colónias leva ~ 10 dias. Certifique-se de envolver as placas com sacos de plástico e adicionar papel absorvente dentro para apagar-se a condensação de líquido. ciclos de evaporação e condensação de outra forma pode fornecer rotas filme líquido para os contaminantes para entrar nas placas. Carregar as placas nas pilhas relevantes como fontes para picking colónia robótica (Figura 2). Escolha colónias para 384 matrizes em placas rectangulares, e crescê-las a 21 ° C com iluminação (~ 1 semana). Condensar a 384 matrizes em uma 1.536-matrizes (4: 1) usando um robô-plaqueamento de réplicas (Figura 3), e permitir que as placas se crescer durante ~ 3 dias a 21 ° C incubadora. Replicar os 1.536-matrizes para duas placas de cada um e colocar um na C incubadora de 21 ° (permissivatemperatura) e o outro numa incubadora de 33 ° C (temperatura restritiva). Na sequência de 24 horas, replicar as placas de 33 ° C a um novo conjunto de placas pré-aquecido, e colocá-los no 33 ° C incubadora. Observação: A razão para isto é que o chapeamento secundário mutantes ts letal pode, em alguns casos acumular biomassa substancial, mesmo que as células são presos no primeiro ciclo celular após o plaqueamento. A réplica secundária elimina este sinal e aumenta grandemente a sensibilidade. Fotografar as placas com uma câmera digital após 3 dias de crescimento a 33 ° C e 5 dias de crescimento a 21 ° C. Segure as placas em um quadro fixo. Usar uma "grelha de placa" marcado com nove indicadores de alinhamento que é fotografada em conjunto com as placas de cultura (Figura 4). placas de cultura de fotografia como alternada emparelhado 21 ° (21/33) as imagens 33 ° C C e. NOTA: os tempos de incubação diferentes são usados ​​para equalizar crescimento desde o tipo selvagem cresce significativamentemais rápido a 33 ° C do que a 21 ° C. 2. Identificação dos candidatos mutantes ts: Primeira Tela Processar os pares 21/33 imagens das chapas com um costume Matlab software de análise de imagem para eliminar o fundo e para o segmento as imagens em um 1.536-matriz. O programa irá determinar a biomassa detectado (intensidade total de pixels) em cada posição (Figura 5). NOTA: O software (fornecida no SI juntamente com instruções) vai usar a imagem da grade de placa para determinar as localizações de células (entradas individuais) em uma 1536-matriz no alinhamento ampliação e placa utilizada e calcular a intensidade total de pixels em cada célula . Estes valores para cada mutante são então comparados com os parâmetros ajustáveis para determinar o crescimento requerida a 21 ° C em relação a um TS + padrão e o grau de temperatura-sensibilidade, definida como: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), em que S é o sinal (pixeltensity após a subtracção de fundo), Mut é um mutante individual, e "WT" é um escolhido aleatoriamente colónia não-sensível à temperatura (estirpe mutagenizada que tinha ts + fenótipo). Crescimento a 21 ° C é definido como S (Mut 21) / S (WT 21). Nesta primeira tela, aplicar critérios de selecção relaxado (permitindo relativamente baixo crescimento a 21 ° C e um grau relativamente baixo de sensibilidade à temperatura) para manter a falsa baixa taxa negativa. Coloque a lista de colónias seleccionadas gerados pelo software como um arquivo de instrução para a colheita robótica (tipicamente em um 384-array) single-colônia. Preparar as placas de origem e de destino de acordo com as instruções de robótica e escolher colónias a matriz (Figura 6). NOTA: catadores convencionais exigem um arquivo de instruções em algum formato, como .csv, .txt ou .xls. Todos os catadores terá a capacidade de ser orientada para o arquivo; diferentes formatos exigirá edição menor do código MATLAB (código-fonte fornecido). </li> Coloque as placas-alvo na C incubadora de 21 ° para ~ 5 dias para crescer uma placa de estoque. 3. Identificar mutantes TS: Segunda Tela Repita o passo 2.1 para testar novamente colónias escolhidas. Tipicamente 30 – 50% das colónias irão testar novamente ts como claras letais, para um rendimento de 2% – 5% em relação ao ts letais colónias sobreviventes iniciais mutagénese UV. Repita o passo 2.2 para escolher os letais ts duas vezes-selecionados, mas com um arquivo de instrução modificado projetado para colônias de matriz em blocos de 100 colônias em placas retangulares em um 384-densidade. Isto é conveniente para o exame microscópico no passo seguinte. O formato de arquivo de instrução é especificado em tempo de execução pelo código MATLAB. Certifique-se incluir várias colónias WT como um controle e colocar as placas a 21 ° C durante ~ 5 dias. 4. Determinação Fenótipo inicial Replicar as placas de 100 blocos dispostos na etapa 3.2 e colocá-los no C incu 21 °bator para ~ 2 dias para obter colónias recém-crescimento. Replicar a nova cópia das placas 100-bloco (4.1) para três cópias. Coloque uma cópia na incubadora a 21 ° C e um C na incubadora de 33 °, como controles. Coloque a terceira cópia ( "screening placas") em uma configuração robótico, e identificar as colónias com pinos tempo tocou com água esterilizada. NOTA: células Chlamydomonas fixadas ao agar roboticamente tendem a terra inicialmente como um local bastante densa de células, com poucas células individuais disponíveis para inspeção microscópica. Para otimizar as colônias para a inspecção microscópica, detectar as células inicialmente transferidos com uma gota de água (o volume de água transferido pelas longas pinos robóticos é ~ 100 nl). Isto resulta na dispersão das células num raio pequeno (~ 1 mm) sobre o centro de fixação inicial, com muitas células individuais isoladas. Tome fotomicrografias de uma região de cada ponto das placas de triagem no momento 0 (enquanto ainda único, células não divididas) (A Figura 7) e colocar as placas a 33 ° C durante a incubação. Determinar a localização de imagem, através do controlo manual do estágio de um microscópio de dissecação tétrade modificada ajustado para dar paradas no espaçamento de 4,5 mm de centro a centro de uma matriz de 384 densidade. Remova as placas de rastreio do C incubadora de 33 ° e tomar microfotografias, como na etapa 4.4, em diferentes pontos de tempo (10 h, 20 h, 48 h). Certifique-se a fase, o suporte da placa, e o controlador de fase são precisamente calibrado para obter imagens das mesmas células em cada ponto de tempo. Execute aquisição photomicrograph rápido (~ 10 min). Use a segunda cópia no 33 ° C incubadora para verificar o fenótipo ts e para se certificar de que as flutuações de temperatura durante a aquisição de imagens não têm grande efeito sobre ts fenótipo. Analisar imagens microscópicas e seleccionar para os mutantes com base nos critérios desejados (Figura 8). Manchar o conjunto selecionado final em uma placa de ágar de 96 vestidos. Certifique-se de que cadaplaca contém mutantes do mesmo tipo de acasalamento e resistência aos medicamentos. Para cada placa, incorporar as duas últimas colunas um (mutação consulta) positivo e um controlo negativo (WT) para o ensaio de complementação. 5. Complementação e Linkage ensaio de novos mutantes para "Frequent Flyers" Transferir grandes quantidades de colónias dispostas de forma gameta-indução livre de azoto 10 em microplacas de 96 poços (densidade de cada colónia deve ser cerca de 0,2 OD). Incubar as placas sob a luz (13-20 W mercúrio lâmpadas) durante ~ 5 horas para permitir que a gametogênese. NOTA: Este passo pode ser realizado, quer com uma configuração robótico replicar manualmente ou com um dispositivo de metalização simples. Suspender consultas com os tipos de acasalamento opostos que abrigam as cassetes de resistência alternativos em tubos com meio de gametas por indução livre de azoto 10 para gametogênese. Misturar as amostras em uma placa-alvo em um MIXT acasalamentovolume de Ure de 20 ul (Figura 9). Seguindo ~ 10 min sob a luz, spot 5 mL de cada poço duas vezes: uma em uma placa TAP para testes de ligação e uma vez na TAP + 5? M Paro + 9 mM Hygro para testes de complementação. Incubar as placas de ligação no 21 ° C incubadora durante a noite e, em seguida, envolvê-los em papel alumínio. Mantê-los no escuro durante 5 dias para permitir a formação zygospore. Incubar as placas de teste de complementação para ~ 10 dias à luz a 21 ° C. NOTA: Os valores de drogas são calibrados para permitir a sobrevivência de diplóides duplamente heterozigotos, mas eles ainda são suficientes para eliminar os haplóides de acasalamento. Esses valores foram calibrados para integrações cassete de resistência padrão utilizadas neste projeto específico; com novas integrações, as doses devem ser recalibrado. A maior parte da biomassa é verificado para ser diplóides por citometria de fluxo (Figura 9), embora a um nível variável de haplóides (provavelmente da meiose e crescimento de resistente duplamentesegregantes) é geralmente observado como bem. Replicar as placas de teste de complementação em duas cópias para a identificação fenótipo ts-. Coloque uma cópia a 21 ° C e uma cópia a 33 ° C durante ~ 5 dias. Colónias de ensaio para o fenótipo ts-, como descrito na secção 2.1 (Figura 5). As colónias que não estão complementando com a consulta provavelmente representam alelos do mesmo gene que a consulta (diplóides hetero-alélicas para mutações no mesmo gene). Para os testes de ligação, seguindo o passo 5.4, mudar as placas de volta à luz para permitir a meiose e crescimento de segregantes haplóides para ~ 7 dias. Replicar placas de ensaio de ligação a TAP + 10 uM e 10 uM Paro Hygro para seleccionar para os descendentes de duplos-resistente (prevê-se ser de 25% da progenia haplóide, uma vez que as cassetes são não ligados) e incubar a 21 ° C durante uma semana. NOTA: Aumentar a dosagem da droga para haplóides resistentes duplamente. colónias de teste para o fenótipo ts-, como eun passo 2.1. NOTA: Um fenótipo ts- é esperado (e observada) para os mutantes no mesmo grupo de complementação como a consulta. Além disso, um fenótipo ts- no ensaio de ligação, para um mutante que complementa a consulta, pode reflectir ligação apertada entre a consulta e a nova mutação. Mutantes que complementam as consultas testados são novos genes prováveis ​​que entrarão no gasoduto para a identificação de bioinformática da lesão causal, e, finalmente, para posterior análise fenotípica.