ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します<em>クラミドモナス</em

1. UV突然変異誘発トリス-酢酸-リン酸（TAP）と200長方形の寒天平板培地9,10 – 100のバッチを準備します。数日後に控え、これらのプレートを用意し、次のステップに懸濁した細胞の迅速な吸収を確実にするために乾燥させるためにベンチに保管してください。 0.2への文化クラミドモナス細胞まで- 0.5の光学密度（OD 750;〜2日）液体TAPの100ミリリットルの光の下で、25℃および100 rpmで振とう。 注：Mat-ハイグロrを（ハイグロマイシンBに対する耐性を付与する）とマット+パロR（パロモマイシンに対する耐性を付与する）：UV突然変異誘発は、二つの遺伝的背景に独立して行われます。抗生物質の選択は、2つの接合型が相補的な薬剤耐性を有する設け、任意です。 細胞が生存し、健康（水泳・未）、および汚染なしであることを保証するために、顕微鏡下で培養物の各々のサンプルを確認してください。 注：生い茂る文化「クラッシュ」と位相差顕微鏡で「ゴースト」として表示され、生存能力を失います。彼らは飽和状態に達すると行くシェーカー培養を保管しないでください。 「ゴースト」現象は、ステップ1.3で容易に検出可能です。 0.003 OD 750に文化を希釈します。株は運動性であり、光に反応して、方向泳ぐように、均質な密度を確保するためにアルミホイルで瓶を包みます。 600生存者コロニープレート（ 図1）上に形成することになる-細胞死滅を占め、200はそのように、計画されたUV線量に基づいて、懸濁液の密度を調整します。 UV露光時間については、 表1を参照してください。 汚染を防ぐために、製造元の指示に従って、液体ディスペンサーにフィットする小型のチューブカセットを取り付け、殺菌のための一連の洗浄を行います。 8×12液体ディスペンサーを使用して、長方形のプレート上に2μlの各4×96滴を分配する（ 図1 </strong>）。すべてのマージが液体の薄いシートに落下確保し、直ちに光への暴露を防止するために、プレートをカバーするために、プレートの縁に緩やかにタップします。 、非常に均一な単一細胞分散を確実に上述したように、乾燥したプレートを使用し、すぐに光に応答して水泳から細胞を防ぐために、プレートをカバーします。すべての液体が吸収されるまで覆われたプレートレベルと暗所に保管してください。 生存者の間でTS-突然変異体の最適な収率を与えることを経験的に決定された時間の期間のための殺菌UVランプ（30ワット殺菌UVチューブ）の下にプレートを置きます。 99.9％の殺害 – 90になり、50センチメートル – 40の距離で1.5分 – ここでは、0.5の時間を使用。千UV誘発点突然変異、の〜10％の変化コーディング配列 – 生存者は100を含んでいます。 ためには、このステップでは、光による依存性DNA修復11,12にノーと復帰して暗所での作業をUV照射の最大効力を保証するために、すぐにパック照射後暗箱でプレート。 室温で24時間 – 8暗所でプレートを保管してください。 コロニーを形成する照明で21℃のインキュベーターでプレートを置きます。コロニー形成は、10日〜かかります。ビニール袋でプレートをラップし、液体結露を吸い取るために内部に吸収紙を追加してください。汚染物質がプレートを入力するための蒸発と凝縮のサイクルは、そうでなければ液膜のルートを提供することができます。 ロボットコロニーピッキング（ 図2）のソースなどの関連スタックにプレートをロードします。長方形のプレート上で384アレイのコロニーを選んで、照明（〜1週間）で21℃でそれらを成長させます。 1536アレイ（4：1）中に384配列を凝縮レプリカメッキロボットを用いた（ 図3）、そしてプレートを21℃のインキュベーター中で2~3日間増殖することを可能にします。 各二つのプレートに1536-配列を複製し、（21℃のインキュベーターに許容1を配置温度）および33℃のインキュベーター（制限温度の他）。 24時間後、予め温めたプレートの新しいセットに33℃でプレートを複製し、33℃のインキュベーターに置いてください。 注：この二次めっき理由は、それは致命的な変異体は、いくつかの場合において、細胞をプレーティングした後、最初の細胞周期で逮捕されていても、実質的にバイオマスを蓄積することができるtsはあります。セカンダリレプリカは、この信号を排除し、大幅に感度を向上させます。 33℃での成長の3日後および21℃での成長の5日後に、デジタルカメラでプレートを撮影。固定フレームにプレートを保持します。培養プレート（ 図4）と一緒に撮影された9位置合わせインジケータでマークされた「グリッド・プレート」を使用してください。交番として写真培養プレートを21°Cと33°C（33分の21）の画像をペアリング。 注：野生型は、有意に増大するので、様々なインキュベーション時間は、成長を均等化するために使用され高速33℃で、21℃よりも。 TS突然変異体候補の2同定：最初の画面 1536アレイに画像の背景を排除するために、カスタムMatlabの画像解析ソフトと対になった33分の21のプレート画像を処理し、セグメントに。プログラムは、それぞれの位置（ 図5）で検出されたバイオマス（総画素強度）を決定します。 注：（指示と共にSIで提供）ソフトウェアが使用倍率とプレートのアライメントで1536アレイ内のセル（個々のエントリ）の位置を決定するために、グリッドプレートの画像を使用し、各セル内の全ピクセル強度を計算します。各変異体のためのこれらの値は、21°のように定義された標準のts +および温度感受性の程度のC相対的で必要な成長を決定するために調整可能なパラメータと比較される：S（ムート33）/ S（WT 33）/ S（ムートSは信号（ピクセルである21）/ S（WT 21）、バックグラウンドを差し引いた後のtensity）は、ムートは、個々の変異体であり、「WT」は、ランダムに選択された非温度感受性コロニーのts +表現型を持っていた（変異誘発株）です。 21℃での増殖は、S（ムート21）/ S（WT 21）として定義されます。この最初の画面では、偽陰性率を低く保つために（21℃の比較的低い成長と温度感度の比較的低い度を可能にする）リラックスした選択基準を適用します。 シングルコロニーピッキングロボット（一般的に384配列に）のための指示ファイルなどのソフトウェアによって生成された選択されたコロニーのリストをロードします。ロボット工学の指示に従って、ソースとターゲットプレートを準備した （ 図6）配列にコロニーを選択します。 注：従来のピッカーは、.csvファイル、.txtファイル、または.XLSのように、いくつかの形式で指示ファイルが必要です。すべてのピッカーは、ファイル駆動させる能力を持つことになります。異なるフォーマットは、MATLABコード（ソースコード提供）のマイナーな編集が​​必要になります。 </li> ストックプレートを成長させるために〜5日間21℃のインキュベーターにターゲットプレートを置きます。 3.のts変異体の同定：第二画面を選んだコロニーを再テストするための手順を繰り返し2.1。典型的には30 – UV変異誘発を存続初期コロニーに比べて5％のts致死 – コロニーの50％は、2％の収率のために、クリアのts致死を再テストします。 繰り返し二回スクリーニングのts致死を選ぶためのステップ2.2が、384密度で長方形のプレート上の100個のコロニーのブロックに配列コロニーに設計変更された指示ファイルを持ちます。これは、次のステップで便利な顕微鏡検査のためのものです。指示ファイル形式は、MATLABコードによって実行時に指定されています。 コントロールとして、いくつかのWTコロニーを含み、〜5日間、21℃でプレートを配置することを確認します。 4.初期の表現型決意ステップ3.2に配列された100-ブロックプレートを複製し、21℃のincuに配置しますたて増殖するコロニーを得るために〜2日間ウランバートル。 3コピーに100ブロックプレート（4.1）の新しいコピーを複製します。 21℃のインキュベーターやコントロールなどの33℃のインキュベーターで1に一つのコピーを配置します。 ロボットのセットアップに第三のコピー（ "プレートをスクリーニング」）を置き、滅菌水で触れた長いピンでコロニーを発見。 注：寒天に固定クラミドモナス細胞は、ロボット顕微鏡検査のために利用可能ないくつかの単一細胞で、細胞のかなり密なスポットとして最初に上陸する傾向があります。 （ロボット長いピンによって転送水の体積は〜100ナノリットルである）、顕微鏡検査のためのコロニーを最適化一滴の水で最初に移入された細胞を発見するには。これは、多くの孤立した単一細胞で、初期のピン止め中心を中心半径が小さい（〜1ミリメートル）で細胞の分散につながります。 （まだ単一の分割されていない細胞間）（時間0でスクリーニングプレートの各スポット領域の顕微鏡写真を撮ります図7）とのインキュベーションのために33℃でプレートを配置します。 384密度アレイの4.5 mmの中心間距離で停止を与えるように設定変更された四分子解剖顕微鏡の手動ステージ制御により、画像の場所を決定します。 時点（10時間、20時間、48時間）を変化させて、33℃のインキュベーターからスクリーニングプレートを取り外し、顕微鏡写真を取り、ステップ4.4のように。ステージ、プレートホルダー、及びステージコントローラを正確に毎回ポイントで同じ細胞の画像を取得するために校正されていることを確認します。迅速な顕微鏡写真の取得（〜10分）を行います。 ts表現型を確認し、画像取得時の温度変動がtsの表現型には大きな影響を及ぼさないことを確認するために、33℃のインキュベーター中で第二のコピーを使用してください。 顕微鏡画像を分析し、所望の基準に基づいて変異体（ 図8）を選択。 96並べ寒天プレートの最後の選択されたセットを発見。ことを確認し、各プレートは、同じ交配型と薬剤耐性の変異体が含まれています。 各プレートについて、最後の2つの列の正（クエリ変異）と相補性アッセイのための負（WT）コントロールを組み込みます。 5.新しい変異体の補完と連携テスト」マイレージプログラム」へ 96ウェルマイクロプレート（各コロニーの密度は約0.2 ODでなければならない）で媒体10窒素を含まない配偶子誘導に配列されたコロニーを大量に転送します。配偶子形成を可能にするために〜5時間 – （20 W水銀電球13）光の下で培養します。 注：この手順は簡単なメッキ装置を用いて複製するロボットのセットアップまたは手動のいずれかで行うことができます。 配偶子形成のための窒素を含まない配偶子誘導培地10とチューブに代替耐性カセットを保有反対の接合型を持つクエリを一時停止します。 交配MIXTにターゲットプレートにサンプルを混ぜます20μlの（ 図9）のUREボリューム。続いて〜光の下で10分間、各ウェル二回からスポットを5μl：一度リンケージ試験のためのTAPプレート上で、かつて相補性試験のためのTAP + 5μMパロ+ 9μMハイグロに。 一晩21℃のインキュベーター内でリンケージプレートをインキュベートし、次いでホイルでそれらをラップします。接合胞子形成を可能にするために5日間暗所に保管してください。 21℃での光の中で10日間〜のための相補性テストプレートをインキュベートします。 注：薬物の量は、二重ヘテロ接合二倍体の生存を可能にするために較正され、彼らはまだ交配半数体を除去するのに十分なされています。これらの金額は、この特定のプロジェクトで使用される標準的な耐性カセットの統合のために較正しました。新しい連動で、用量を再較正する必要があります。ほとんどのバイオマスは、フローサイトメトリー（ 図9）によって二倍体であることが確認されているが、おそらく減数分裂と二重耐性の成長から半数体（の可変レベル分離個体）は、通常、同様に観察されます。 TS-表現型の識別のための2つのコピーに相補テストプレートを複製します。 〜5日間33℃で21℃で1コピーと一つのコピーを配置します。 2.1節で説明したように、TS-表現型のためのテストコロニー、（ 図5）。そうクエリで補完されていないコロニーは、クエリ（同じ遺伝子の突然変異のための二倍体は、ヘテロ対立遺伝子）と同じ遺伝子の対立遺伝子を表します。 リンケージ試験のために、ステップ5.4以下、〜7日間半数体分離体の減数分裂と伸長を可能にするためにバックライトにプレートをシフトします。 （カセットがリンク解除されているので、一倍体の子孫の25％であると予測）、二重耐性子孫のために選択して、週に21℃でインキュベートし、TAP + 10μMパロおよび10μMハイグロへの結合テストプレートを複製します。 注：二重耐性半数体のための薬剤の投与量を増やします。 私としてTS-表現型のための試験コロニー、nは2.1ステップ。 注：TS-表現型は、クエリと同じ相補群における突然変異体について予想（観察）されます。また、リンケージアッセイにおけるTS-表現型は、クエリを補完する変異体について、クエリと新しい突然変異の間の緊密な連携を反映することができます。試験されたクエリを補完する変異体は、原因となる病変のバイオインフォマティクス同定するための、そして最終的にさらなる表現型分析のためにパイプラインに入ることになる可能性の高い新たな遺伝子です。