High-throughput robotizzata Assisted Isolamento di sensibile alla temperatura letale Mutants in<em> Reinhardtii Chlamydomonas</em

1. mutagenesi UV Preparare un lotto di 100 – 200 piastre di agar rettangolari con Tris-acetato-fosfato (TAP) di media 9,10. Preparare questi piatti un paio di giorni in anticipo e tenerli in panchina ad asciugare al fine di garantire un rapido assorbimento delle cellule sospese nei passaggi successivi. Cultura Chlamydomonas cellule fino a 0,2-,5 densità ottica (OD 750; ~ 2 giorni) in 100 ml di TAP liquido sotto la luce, a 25 ° C e agitazione a 100 rpm. NOTA: mutagenesi UV viene eseguita in modo indipendente in due background genetico: Mat- Hygro r (conferisce resistenza alla Hygromycin B) e Mat + Paro r (conferisce resistenza alla Paromomicina). scelta antibiotico è arbitraria, a condizione che i due tipi di accoppiamento hanno resistenze farmacologiche complementari. Controllare un campione di ciascuna delle culture al microscopio per garantire che le cellule sono vitali, sani (nuoto e intatto), e senza contaminazione. NOTA: culture Overgrown "crash" eperdere vitalità, che appare come "fantasmi" nella microscopia a contrasto di fase. Non tenere culture shaker andare una volta raggiunta la saturazione. Il fenomeno "fantasma" è facilmente individuabile nella fase 1.3. Diluire la cultura a 0.003 OD 750. Avvolgere la bottiglia con un foglio di alluminio per garantire la densità omogenea, come il ceppo è mobili e nuota direzionalmente in risposta alla luce. Regolare la densità della sospensione sulla base della dose UV previsto, in modo che la contabilità per l'uccisione delle cellule, 200 – 600 colonie superstiti formeranno sulle piastre (Figura 1). Vedere la Tabella 1 per le informazioni su tempi di esposizione ai raggi UV. Attaccare una cassetta piccolo tubo che si inserisce un dosatore ed eseguire una serie di lavaggi per la sterilizzazione, secondo le istruzioni del produttore, per prevenire la contaminazione. Utilizzando un dosatore 8 x 12, dispensare 4 x 96 gocce di 2 microlitri ciascuno su piastre rettangolari (Figura 1 </strong>). Premere leggermente sul bordo della piastra di assicurare la fusione di tutte le gocce in un sottile foglio di liquido e coprire immediatamente le piastre per evitare l'esposizione alla luce. Per garantire molto anche singola dispersione cellulare, utilizzare lastre secche, come detto sopra, e rapidamente coprire le piastre per evitare che le cellule dal nuoto in risposta alla luce. Mantenere il livello di piastre coperto e al buio fino a quando viene assorbito tutto il liquido. Posizionare le piastre sotto una lampada UV germicida (30 watt tubo UV germicida) per periodi di tempo determinati empiricamente per dare una resa ottimale di mutanti TS tra i sopravvissuti. Qui, utilizzare tempi di 0,5 – 1,5 minuti ad una distanza di 40 – 50 cm al risultato nel 90 – 99,9% abbattimento. I sopravvissuti contengono 100 – 1.000 mutazioni puntiformi indotte dai raggi UV, di cui ~ sequenze codificanti 10 Variazione%. Al fine di garantire la massima potenza di irradiazione UV senza ritorno a causa di DNA dipendente dalla luce riparare 11,12, il lavoro al buio a questo passaggio e subito imballare lapiastre in una scatola buia dopo l'irradiazione. Conservare le piastre al buio per 8 – 24 ore a temperatura ambiente. Posizionare le piastre in un incubatore a 21 ° con illuminazione di formare colonie. la formazione di colonie prende ~ 10 giorni. Assicurarsi di avvolgere le piastre con i sacchetti di plastica e aggiungere carta assorbente all'interno di cancellare fino condensa liquida. Evaporazione e condensazione cicli altrimenti in grado di fornire percorsi di film liquidi per i contaminanti di entrare nei piatti. Caricare le piastre in pile pertinenti come fonti di raccolta colonia robotica (Figura 2). Scegliere colonie per 384-array su piastre rettangolari, e farle crescere a 21 ° C con illuminazione (~ 1 settimana). Condensare il 384-array in un 1.536-array (4: 1) usando un robot replica-placcatura (Figura 3) e consentono le piastre di crescere per ~ 3 giorni in C incubatore 21 °. Replicare i 1.536-array a due piatti ciascuno e mettere uno in C incubatore 21 ° (permissivatemperatura) e l'altro in un 33 ° C incubatore (temperatura restrittivo). Dopo 24 ore, replicare le piastre a 33 ° C ad una nuova serie di piastre pre-riscaldato, e metterli in C incubatore 33 °. NOTA: La ragione di questo è che la placcatura secondaria ts mutanti letali può in alcuni casi accumulano sostanziale biomassa, anche se le cellule vengono arrestati nel primo ciclo cellulare dopo la placcatura. La replica secondaria elimina questo segnale e aumenta notevolmente la sensibilità. Fotografare i piatti con una macchina fotografica digitale dopo 3 giorni di crescita a 33 ° C e 5 giorni di crescita a 21 ° C. Tenere le piastre in un telaio fisso. Usare una "griglia-plate" contrassegnato con nove indicatori di allineamento che è stata fotografata insieme alle piastre di coltura (Figura 4). piastre di coltura fotografia come alternata accoppiati 33 ° C (21/33) le immagini a 21 ° C e. NOTA: diversi tempi di incubazione consentono di compensare la crescita in quanto il tipo selvaggio cresce in modo significativoveloce a 33 ° C che a 21 ° C. 2. Identificazione dei candidati Mutant ts: Prima schermata Elaborare le immagini 21/33 piatto abbinato a un software di analisi Matlab immagine personalizzata per eliminare lo sfondo e di segmentare le immagini in un 1.536-array. Il programma determina la biomassa rilevato (intensità totale pixel) in ciascuna posizione (figura 5). NOTA: Il software (fornito nel SI insieme alle istruzioni) utilizzeranno l'immagine della griglia a lamelle per determinare le posizioni di celle (singole voci) in un 1.536-array presso l'allineamento di ingrandimento e piastra utilizzata e calcolare l'intensità totale di pixel in ogni cella . Questi valori per ogni mutante vengono poi confrontate con parametri regolabili per determinare la crescita desiderata a 21 ° C rispetto a una ts + standard e il grado di temperatura sensibilità, definita come: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), dove S è il segnale (in pixeltensity dopo sottrazione del fondo), Mut è un mutante individuale, e "WT" è una colonia non sensibile alla temperatura scelta a caso (ceppo mutagenizzato che aveva ts + fenotipo). Crescita a 21 ° C è definita come S (Mut 21) / S (WT 21). In questa prima schermata, si applicano i criteri di selezione rilassato (permettendo relativamente bassa crescita a 21 ° C e un grado relativamente basso di sensibilità alla temperatura) per mantenere la falsa basso tasso negativo. Caricare la lista delle colonie selezionate generati dal software come un file di istruzioni per la singola colonia raccogliendo robotica (tipicamente in un 384-array). Preparare i piatti origine e di destinazione secondo le istruzioni robotica e raccogliere le colonie a matrice (Figura 6). NOTA: raccoglitrici convenzionali richiedono un file di istruzioni in un formato, come ad esempio .csv, .txt o .xls. Tutti i raccoglitori avranno la capacità di essere di file-driven; diversi formati richiederanno la modifica minore del codice MATLAB (codice sorgente fornito). </li> Posizionare le piastre di destinazione nella cartella C incubatore 21 ° per ~ 5 giorni di tempo per crescere un piatto stock. 3. Identificazione ts Mutanti: secondo schermo Ripetere il passaggio da 2.1 a ripetere il test colonie raccolte. Tipicamente 30 – 50% delle colonie sarà ripetere il test ts come chiari letali, per un rendimento del 2% – 5% ts letali rispetto a colonie sopravvissute iniziali mutagenesi UV. Ripetere il passaggio 2.2 per la raccolta delle ts letali due volte schermati, ma con un file di istruzioni modificato progettato per colonie matrice in blocchi di 100 colonie su piastre rettangolari a 384 densità. Questo è per un comodo esame microscopico nel passaggio successivo. Il formato del file di istruzioni è specificato in fase di esecuzione dal codice MATLAB. Assicurati di includere diverse colonie WT come controllo e posizionare le piastre a 21 ° C per ~ 5 giorni. 4. Determinazione fenotipo iniziale Replicare le piastre 100 blocchi schierati al punto 3.2 e metterli in C incu 21 °Bator per ~ 2 giorni per ottenere colonie di recente crescita. Replicare la nuova copia delle piastre 100-blocco (4.1) a tre copie. Inserire una copia in C incubatore 21 ° e uno in C incubatore 33 ° come controlli. Posizionare la terza copia ( "screening piastre") in una configurazione robotica, e individuare le colonie con lunghe spine toccato con acqua sterilizzata. NOTA: le cellule Chlamydomonas appuntato agar robot tendono a terra inizialmente come una macchia piuttosto densa delle cellule, con poche singole celle disponibili per l'ispezione al microscopio. Per ottimizzare le colonie di ispezione microscopica, individuare le cellule inizialmente trasferiti con una goccia d'acqua (volume di acqua trasferita dai perni lunghi robotici è ~ 100 nl). Ciò provoca dispersione delle cellule in un piccolo raggio (~ 1 mm) intorno al centro pinning iniziale, con molte singole cellule isolate. Prendere microfotografie di una regione di ogni spot delle piastre di screening al tempo 0 (mentre ancora single, cellule indivise) (Figura 7) e posizionare le piastre a 33 ° C per l'incubazione. Determinare la posizione dell'immagine tramite il controllo manuale di fase di un microscopio tetrade dissezione modificata impostato per dare fermate al 4,5 mm spaziatura da centro a centro di una matrice di 384 densità. Rimuovere le piastre di screening del C incubatore 33 ° e prendere microfotografie, come al punto 4.4, a diversi intervalli di tempo (10 ore, 20 ore, 48 ore). Assicurarsi che il palco, il portatarga, e il controller stadio sono precisamente calibrato per ottenere immagini delle stesse cellule in ogni punto del tempo. Eseguire acquisizione microfotografia rapida (~ 10 min). Utilizzare la seconda copia C incubatore 33 ° per verificare il fenotipo ts e per assicurarsi che le fluttuazioni di temperatura durante l'acquisizione dell'immagine hanno effetto importante sul ts fenotipo. Analizzare le immagini microscopiche e selezionare per i mutanti in base ai criteri desiderati (Figura 8). Spot the set selezionato finale di una piastra di agar-96 schierati. Assicurarsi che ogniPiastra contiene mutanti dello stesso tipo di accoppiamento e resistenza ai farmaci. Per ciascuna piastra, inserire le ultime due colonne positivo (query mutazione) e un controllo negativo (WT) per il dosaggio complementazione. 5. complementazione e Linkage sperimentazione di nuovi mutanti di "frequent flyer" Trasferire grandi quantità di colonie disposti a medio-gameti induzione esente da azoto 10 a 96 pozzetti (densità di ogni colonia dovrebbe essere di circa 0,2 OD). Incubare le piastre sotto la luce (13-20 W mercurio lampadine) per ~ 5 ore per consentire gametogenesi. NOTA: Questo passaggio può essere condotta sia con una configurazione robotica replicare o manualmente con un semplice dispositivo di placcatura. Sospendere query con i tipi di accoppiamento opposti che ospitano le cassette di resistenza alternativi in tubi con media dei gameti-induzione esente da azoto 10 per gametogenesi. Mescolare i campioni in una piastra segnale in un accoppiamento mixtVolume ure di 20 microlitri (Figura 9). A seguito di ~ 10 minuti sotto la luce, il punto 5 ml di ogni ben due volte: una volta su un piatto TAP per il test di collegamento e una volta su TAP + 5 micron Paro + 9 micron Hygro per il test complementazione. Incubare le piastre di collegamento nel 21 ° C incubatore per una notte, e poi avvolgerli in carta stagnola. Tenerli al buio per 5 giorni per permettere la formazione zygospore. Incubare le piastre complementazione-prova per circa 10 giorni alla luce a 21 ° C. NOTA: Gli importi della droga sono tarati per consentire la sopravvivenza di diploidi doppiamente eterozigoti, ma sono ancora abbastanza per eliminare i aploidi di accoppiamento. Tali importi sono stati calibrati per integrazioni cassetta di resistenza standard utilizzati in questo specifico progetto; con nuove integrazioni, le dosi devono essere ricalibrati. La maggior parte della biomassa è verificato per essere diploidi mediante citometria di flusso (figura 9), anche se un livello variabile di aploidi (probabilmente da meiosi e la crescita di doppiamente resistentesegreganti) è di solito osservato pure. Replicare le piastre di complementazione-test in due copie per l'identificazione fenotipo TS. Mettere una copia a 21 ° C e una copia a 33 ° C per ~ 5 giorni. Colonie di prova per il fenotipo TS, come descritto nella sezione 2.1 (Figura 5). Le colonie che non sono integrando con la query probabilmente rappresentano alleli dello stesso gene, come le query (diploidi etero-alleliche per le mutazioni nello stesso gene). Per il test di collegamento, seguendo passo 5.4, spostare le piastre di nuovo alla luce per consentire la meiosi e conseguenza di segreganti aploidi per ~ 7 giorni. Replicare le piastre di test di collegamento a TAP + 10 micron Paro e 10 micron Hygro di selezionare per progenie doppio-resistenti (previsti al 25% della progenie aploide, dal momento che le cassette non sono collegate) e incubare a 21 ° C per una settimana. NOTA: Aumentare il dosaggio del farmaco per aploidi doppiamente resistenti. colonie di prova per il fenotipo TS, come hon punto 2.1. NOTA: è previsto un fenotipo TS (e osservato) per mutanti nello stesso gruppo di complementazione come la query. Inoltre, un fenotipo TS nel saggio linkage per un mutante che integra la query, può riflettere stretto collegamento tra l'interrogazione e la nuova mutazione. Mutanti che completano le query testati sono probabili nuovi geni che entreranno cantiere per l'identificazione bioinformatica della lesione causale, e in ultima analisi, per ulteriori analisi fenotipica.