Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in<em> Chlamydomonas reinhardtii</em
Summary
Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.
Abstract
Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.
Introduction
Phänotypischen Charakterisierung der systematischen Mutant Sammlungen von Modellorganismen ist ein bewährtes Konzept für die zelluläre Komplexität zu sezieren. Die haploiden Einzeller Grünalge Chlamydomonas reinhardtii hat eine pflanzenähnliche Gen – Set, aber es wichen von Landpflanzen vor mehreren Genom Doppelungen in der Landpflanzen Linie 2. Grundsätzlich Mangel an Gen-Duplikation und einer hauptsächlich haploiden Lebenszyklus erheblich erleichtert loss-of-function genetische Ansätze. Jedoch ist gezielte Zerstörung von Genen von Interesse fast unmöglich aufgrund des Fehlens von effizienten homologe genomische Integration. Eine zufällige insertionelle Störung Bibliothek befindet sich im Aufbau, kombiniert mit der Identifizierung der gestörten Stelle, so weit eine gruppierten Satz von 1.935 kartiert Störungen ergeben repräsentieren 1.562 Gene 3. Doch dieser Ansatz (in der Regel erwartet, dass Null-Mutationen erzeugen) ist nicht anwendbar auf essentielle Gene. Temperaturempfindliche (ts) Mutationen können recovere werdend in essentiellen Genen, und die jüngsten Methoden ermöglichen eine effiziente Identifizierung des mutierten Gens und der ursächlichen Läsion. Die phänotypische Analyse bei hoher Temperatur liefert dann sofort Informationen über die Funktion des mutierten Gens. Wir berichteten über die Isolierung und Charakterisierung von ts Letalmutationen in ~ 70 essentielle Gene in Chlamydomonas, wobei der Schwerpunkt vor allem auf beteiligten Gene in der Progression des Zellzyklus und 1,4 steuern.
Ts tödliche Bildschirme haben 5,6 seit Jahrzehnten eine tragende Säule der genetischen Analyse in Mikroorganismen gewesen. Im Prinzip ist ein wünschenswertes Merkmal "Sättigung" zu nähern, was bedeutet, dass alle Gene mutiert fähig Letalität ts durch mindestens eine Mutante identifiziert werden, eine vollständige Analyse ermöglicht. Doch in der Praxis begrenzen mehrere Faktoren, die die Annäherung an die Sättigung. Erstens, während fast alle Gene können zu einem Verlust der Aktivität bei hoher Temperatur mutiert werden, ändert sich die Effizienz der Verwertung solcher Mutanten über mindestenseine Größenordnung 7,8. Daher beginnt ein Zufallsbild rezidivierenden Treffer in "Vielflieger" abholen lange vor der Sättigung nähert. Zweitens, während ts-Mutationen in der Regel zu einer Verringerung der Funktion zur Folge haben, sie nicht wahr nulls bei einer restriktiven Temperatur sein kann (und umgekehrt, sind häufig nicht voll funktionsfähig bei einer permissiven Temperatur). Dieses Problem kann durch den Vergleich mit multiple Allele zu einem gewissen Grad behandelt werden; wenn sie alle einen gemeinsamen Phänotyp teilen, ist dies wahrscheinlich das Ergebnis einer einfachen Inaktivierung des Gens zu reflektieren. Multiple Allele sind auch sehr nützlich für die endgültige molekulare Identifizierung der ursächlichen Läsion 1. Allerdings bedeutet die "Vielflieger" Problem, dass mehrere Allele in selten getroffen Gene schwierig sein kann, sich zu erholen.
Aus diesen Gründen wurden entwickeln wir eine verbesserte Pipeline zu isolieren und phänotypisch ts-Mutanten zu charakterisieren. Wir haben mehr als 3.000 ts-Mutanten bisher gesammelten, including etwa 200 neuen Kandidaten Zellzyklus-Mutationen. Molekulare und phänotypische Analyse dieser Sammlung, die wahrscheinlich bereits Mutationen in den meisten oder allen Zell wesentlicher Wege umfasst, sollten neue Erkenntnisse und Hypothesen in pflanzlichen Zellbiologie bereitzustellen. Wichtig ist, dass diese Pipeline zu jedem Mikroorganismus angewendet werden, die effizient auf Agar wächst auf ts Mutant Sammlungen aufzubauen.
Ein Hinweis auf Ausstattung: zwei Roboter sind sehr wichtig für die Effizienz in diesem Verfahren (eine Kolonie-Picker und eine Kombination Replik plater / Cherry Picker). Pickers haben in der Regel Metallstifte. Picked Kolonien werden in Luft auf diesen Stiften für einen gewissen Zeitraum gehalten (Sekunden bis Minuten, je nach Modell). Chlamydomonas stirbt in etwa 20 Sekunden auf einen Metallstift in der Luft. Dies schränkt Modellwahl für den Organismus. Genauigkeit Angelegenheiten. Unsere Kolonie-Picker ist ziemlich genau; ist es jedoch etwas gewalttätig in seiner Wirkung und hat eine gewisse Möglichkeit für Spray-basierte Kreuzkontamination. Es ist nicht bei hohen verwendeter ist als die 384 Dichte (4,5 mm Mitte-Mitte-Abstand); Bei dieser Dichte ist die Genauigkeit vollständig akzeptabel. Die Replika-Plattierung / Rosinenpickerei Roboter (verschiedene Aufsätze für diese Anwendungen verwendet) ist viel zu Kommissionierung langsamer, ist aber genau genug für die 1.536 Dichte (6144, ist eine Herausforderung, auch für diese sehr präzise Roboter, wir diese Dichte ausgewertet haben, aber nicht gewählt wegen seiner verschiedenen Schwierigkeiten, um es verwenden). Der Roboter wird nicht gut funktionieren , wenn Platten ungleichmäßig belastet werden, usw. Es ist wichtig zu erkennen, überprüfen Sie sicher sein, die richtigen Dinge geschehen; natürlich wird der Roboter laufen unbeaufsichtigt und in der Regel werden alle gut gehen, wenn die ersten Platten korrekt waren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Pipeline hier für High-Yield-Isolierung von ts letalen Mutanten beschrieben wird sichergestellt, dass vermutlich alle zellulären wesentlicher Bahnen des Chlamydomonas-Genom vertreten sind. Die beiden wichtigsten Schritte für eine effiziente Sammlung von Zellzyklusgene und für die Beseitigung von sich wiederholenden "Vielflieger" Allele sind: 1) die kohärente Definition des Anhaltens Phänotyp Merkmale für unvollständige Zellzyklen und 2) die parallele Komplementierung Assay gegen bereits identifizierte Abfrage Gene, die die Sammlung mit neu isolierten diejenigen zu vergrößern.
Wenn durch Hell-Dunkel – Zyklen synchronisiert, wächst Chlamydomonas photo während der Tagesstunden und steigt in Zellgröße> 10 – fach ohne DNA – Replikation oder der Zellteilung 13. Etwa deckungsgleich mit dem Beginn der Nacht, dann Zellen durchlaufen mehrere Zyklen von alternierenden DNA – Replikation, Mitose und Zellteilung (Abbildung 8). Dieser Regulierungs scheme stellt eine natürliche Unterscheidung zwischen Genen, die für Zellwachstum und -integrität und Gene, vor allem erforderlich speziell für den Zellteilungszyklus erforderlich. Wir fanden heraus , dass die 10-Stunden und 20-Stunden – Zeitpunkten sehr informativ sind für eine erste grobe phänotypische 1 geschnitten. Die breite Klassen von ts letalen Mutanten , die wir derzeit erkennen, auf der Grundlage dieser Bilder (siehe SI in Tulin und Cross, 2014) 1, sind: Notch, Popcorn, Runde, Klein, Mittel, frühe Lyse und Multiple-Zyklus (Abbildung 8 ).
Die drei wichtigsten Kategorien konzentrieren wir uns auf sind Notch, Popcorn, und rund. Die "Notch" und "Popcorn" Phänotypen wurden zuvor gezeigt , von den meisten Zellzyklus-spezifischen Läsionen charakteristisch zu sein (beispielsweise mitotische cyclin-dependent kinase, DNA Replikationsmaschinerie und Topoisomerase II) 1. Das Aussehen eines (Notch) oder mehrere (Popcorn) scheinbaren Ebenen der beginnenden, aber erfolglosen Zellteilung ist eine bequeme Morphollogischen Indikator der Zellzyklus-Initiation. Diese Mutanten weisen in der Regel keine oder nur geringe Wachstumsdefekte, mit einem Anstieg der Zellvolumen ähnlich wie WT an der 10-Stunden-Marke. Die Notch und Popcorn Phänotypen sind in 10 Stunden offensichtlich und werden von 20 Stunden vollständig entwickelt (häufig mit Zell-Lyse verbunden sind). "Rund" Zellen wachsen ähnlich wie bei WT aber mit stark reduzierten Produktion von scheinbaren anfänglichen Teilungsebenen, so groß, rund arretierten Zellen führt. Zurück Mutanten in dieser Kategorie sind in Komponenten der Anaphase fördernden Komplex 14 oder in Genen , die für Mikrotubuli – Funktion (Tubulin-Falten – Cofaktoren, Gamma-Tubulin – Ring – Komplex) 1 erforderlich gefallen. Zu späteren Zeitpunkten zeigen diese Zellen häufig ausgeprägte Zelllyse.
"Klein" und "Medium" Zellen wachsen entweder vernachlässigbar (Small) oder deutlich weniger als WT (Medium). Viele dieser Mutanten bisher identifiziert haben Läsionen in Genen, deren Anmerkungen vorschlagen Rollen in grundlegenden cellular Wachstumsprozesse (Übersetzung oder Membran-Biogenese). Die wichtigste mikroskopische Unterscheidung zwischen Medium und Rund beruht auf der Menge des Wachstums bei 10 h (Runde: wie WT; Medium: reduziert). Da die kleinen und mittleren Kategorien recht groß sind und wahrscheinlich Läsionen in einem großen Bereich von zellulären Wege zu reflektieren, versuchen wir nicht, diese Kategorien zu sättigen; Allerdings wollen wir die Vertreter der Klasse molekular identifizieren Phänotypen von Verlust in verschiedene Wege zu verstehen. Zwei unstudied Kategorien sind: 1) die frühen Lyse-Mutanten, die Integrität (Verlust der grünen Farbe, Verlust von refractility verlieren) durch die 10-Stunden-Marke, mit wenig Indizien für eine vorherige Zellwachstum und 2) die mehrere Zyklen. Die Zellen vermehren sich in ähnlicher Weise bei 10 und 20 h WT, obwohl sie eine völlige Unfähigkeit zur Durchführung von längerfristigen Verbreitung aufweisen.
Wir charakterisieren meist "Kerbe", "Popcorn" und "rund" und kleine und mittlere Rundzellen auszuschließen, als auchwie undichte Mutanten, die komplette wenigen Zellteilungen. Dies ist vor allem, um sicherzustellen, daß grundlegende zelluläre Funktionen, wie das Wachstum und die Membranintegrität, sind funktionell und die Wahrscheinlichkeit für die Division-verwandte Gene zu bereichern. Dieser Ansatz wird gefunden empirisch effizient zu sein; jedoch kann es sein, dass ein Zellzyklus-Gens pleiotrope ist und früher zusätzliche Rollen in G1, vor der eigentlichen Division. Solche Fälle, die wir erwarten, selten zu sein, werden vermisst. Generell streben wir eine homogene Verhaftung, die durch eine ursächliche Mutation in hoher Wahrscheinlichkeit ist, dass ein völlig dysfunktionalen Protein ist. Jedoch aus dem gleichen Grund, wie gerade beschrieben, kann es mehrere Verhaftung Punkte sein und daher ist eine gewisse Flexibilität bei der Auswahl ratsam Kandidaten.
Um die Sammlung mit neu identifizierten Gene zu bereichern, werden die ausgewählten Kandidaten für die Komplementierung getestet. Wir benötigen ts- in der Positivkontrolle (Abfrage für Abfrage Mutation) und ts + in der Negativkontrolle (query gegen WT). Neue Mutanten in der gleichen Komplementierungsgruppe wie die Abfrage sind ts-. Die Mitgliedschaft in der gleichen Komplementierungsgruppe spiegelt fast immer eine molekulare Läsion im gleichen Gen (dies war der Fall für jedes solches Gen wir getestet haben). Daher ist für "Vielflieger", ist dieses Kriterium für die weitere Charakterisierung ausschließe. Mutanten, die nicht an den gleichen Komplementationsgruppen wie die getesteten Abfragen sind Kandidaten für neue Gene und weiter gekennzeichnet durch Bioinformatik und experimentelle Werkzeuge waren. Sehr variable Rückgewinnung von TS- Allele in verschiedene Komplementierungsgruppen ist ein bekanntes Phänomen, das heißt, Variabilität als Rauschen Poisson deutlich größer ist, aufgrund der großen intrinsischen Variabilität der Veränderlichkeit zwischen verschiedenen Genen zu TS-. Ursachen könnten intrinsische Thermolabilitat Unterschiede umfassen; verschiedene Proteingrößen; das Vorhandensein eines Proteins als Monomer im Vergleich zu als große, komplexe stabilisiert; und mutagene Hot Spots. Dies ist eine fast reine Nuisance. eine resultierende positive Ergebnis ist jedoch, dass die "Vielflieger" Liste ist nicht lang (mit nur ein paar Ziele die meisten der Liste belegen), so dass die arbeitsintensive Komplementierung Prüfung ist nicht eine massive Unternehmen bis in die späteren Phasen des Projekts.
Als komplementärer Ansatz führten wir eine Verknüpfung Assay. In diesem Assay wird doppelt-resistenten Nachkommen werden ausgewählt und sind für die TS- Phänotyp getestet. Ein ts- Phänotyp ist zu erwarten (und beobachtet) für Mutanten in der gleichen Komplementierungsgruppe wie die Abfrage oder für eng verknüpfte Mutationen. Für jede der getesteten Gene wird ein WT Nachkommen (ts + Phänotyp) in einer gewissen Wahrscheinlichkeit auf der genetischen Distanz abhängig erscheinen erwartet. Wir schätzen, dass es etwa 100 Zygosporen für jede Paarung in diesen Punkten. Unter der Annahme 100% meiotischen Effizienz, wird dies dazu führen, um die 100 Doppelarzneimittelresistenten Nachkommen von den unverknüpften drug resistance Kassetten (25% der meiotischen Nachkommen, vier pro Meiose durch Mendelian Vererbung). Dies wäre auch der Fall für TS- Mutationen, wo 25% der Nachkommen werden Doppelmutante sein, und 25% WT sein, wenn die Abfrage und Test Mutationen unlinked sind. Daher aus dem Doppelarzneimittelresistenten Nachkommen derselben, 25% wt (etwa 25 Zellen) sein. Dies ist der Fall für völlig unverbundenen Mutationen; jedoch moderate Verknüpfung (innerhalb von ~ 20 cm, ca. 2 Mb oder 2% des Genoms 115) wird stark reduzieren oder ts + Signal zu beseitigen. Im Fall der Bindung der getesteten Mutation zur antibiotischen Kassette, ts + Haploiden, die doppelt-drug-resistenten liegen in sehr geringen Mengen. Dies manifestiert sich als offensichtliche Versagen bei allen Mutanten zu rekombinieren getestet, trotz Ergänzung alle Mutanten getestet, ein anomales Ergebnis, das leicht festgestellt wird; in solchen Fällen wird Rückkreuzungs das Problem lösen.
Beide von Vorwissen und Sequenzanalyse erwarten wir , Zellzyklus – Gene in der Chlamydomonas etwa 500 Gene 2 zu sein, obwohl most, aber wahrscheinlich nicht alle, sind wesentlich. Wir werden die Notwendigkeit für zusätzliche Mutagenese Runden zu bewerten, da mehr Mutanten und den Grad der Sättigung steigt gesammelt werden.
Dieses Verfahren ist einzigartig entworfen für wesentliche biologische Prozesse zu studieren und die Gene und Proteine, die sie durchführen. Andere Methoden zur Erzeugung Störungen in essentiellen Genen existieren (zB Umwandlung von zufällig mutagenisierten Allele 16, bedingt transkribiert Allele 17 oder hypomorphen Allele 18). Aber sie alle erfordern eine homologe Rekombination, die in vegetativen Chlamydomonas stark unterdrückt wird. Die gruppierte, regelmäßig kurze Palindrom Wiederholung (CRISPR) voneinander beabstandete / Cas9 System als ein mächtiges Werkzeug hergestellt wurde für Genveränderung 19; jedoch ist es noch effizienter 20 in Chlamydomonas zu arbeiten. Entscheidend ist, erfordern alle diese Methoden Vorwissen des Ziels. Dies ist eine schwerwiegende Einschränkungwenn man will, die Möglichkeit zu haben, um etwas Neues zu lernen! Unser Ansatz wird Mutationen zu identifizieren essentielle Gene, unabhängig von einem Vorwissen ergeben. Daher wird bei dem gegenwärtigen Stand der Technik, Isolation von Zufalls ts durch Gen-Identifizierung durch tiefe Sequenzierung Mutationen können die effizienteste Methode, um einen schnellen Einstieg in mikrobiellen Zellbiologie in der Anlage superkingdom sein.
Identifizierung von Mutationen verursachenden (unter ~ 100 codierende Sequenz verändernde Mutationen in jedem Klon) über den Rahmen dieses Papiers ist. Tief Sequenzierung von gebauschten segregant Schwimmbäder 1 ist wirksam , aber arbeitsintensiv. Eine kombinatorische Pool Strategie für die Bestimmung aller Mutationen in einer großen Anzahl von Stämmen, nach einer kleinen Anzahl von Pools Sequenzierung, ist sehr kosten- und arbeitseffizient. Eine neue Strategie für kombinatorische gebauschten segregant Sequenzierung ist in der Entwicklung, die die Identifizierung der ursächlichen Mutationen in Dutzenden von Mutanten ermöglicht simultaneously in einer einzigen Sequenzierungslauf (in Vorbereitung). Diese Wirkungsgrade sind sehr wichtig, die kritische Genidentifizierung Schritt zu halten mit der sehr schnellen Anhäufung von Mutanten zu ermöglichen, die ermöglicht wird durch die hier beschriebenen Verfahren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Kreuz-Labor Mitglieder für die Beratung und nützliche Diskussion. Diese Arbeit wurde von PHS 5RO1-GM078153 unterstützt und durch ein Junior Fellow Award von der Simons-Stiftung Michal Breker.
Materials
| Equipment: | |||
| Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
| MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
| Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |
References
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