À haut débit robotisé Isolation assistée sensible à la température létale Mutants en<em> Chlamydomonas reinhardtii</em

1. UV mutagenèse Préparer un lot de 100 – 200 plaques d' agar rectangulaires avec Tris-Acétate-Phosphate (TAP) moyenne 9,10. Préparer ces plaques quelques jours avant et de les garder sur le banc à sécher pour assurer une absorption rapide des cellules en suspension dans les prochaines étapes. Culture Chlamydomonas cellules jusqu'à 0,2 à 0,5 densité optique (DO 750; ~ 2 jours) dans 100 ml de liquide TAP sous la lumière, à 25 ° C et en agitant à 100 rpm. REMARQUE: la mutagénèse UV est effectuée de manière indépendante dans les deux fonds génétiques: Mat- r Hygro (confère la résistance à l' hygromycine B) + Mat Paro r (résistance à la paromomycine confère). Le choix d'antibiotique est arbitraire, à condition que les deux types d'accouplement ont des résistances médicamenteuses complémentaires. Vérifier un échantillon de chacune des cultures sous le microscope pour veiller à ce que les cellules sont viables, en bonne santé (natation et intact), et sans contamination. NOTE: cultures Overgrown "crash" etperdre leur viabilité, apparaissant comme des «fantômes» en microscopie à contraste de phase. Ne gardez pas les cultures secoueurs aller une fois qu'ils atteignent la saturation. Le «fantôme» phénomène est facilement détectable à l'étape 1.3. Diluer la culture à DO 750 0,003. Envelopper la bouteille avec du papier d'aluminium pour assurer une densité homogène, que la souche est motile et nage directionnellement en réponse à la lumière. Réglez la densité de la suspension en fonction de la dose d'UV prévue, de sorte que la comptabilité pour la destruction de cellules, 200 – 600 colonies de survivants se forment sur les plaques (figure 1). Voir le tableau 1 pour obtenir des informations sur les temps d'exposition aux UV. Fixer une cassette de petit tube qui correspond à un distributeur de liquide et d'effectuer une série de lavages pour la stérilisation, conformément aux instructions du fabricant, pour éviter toute contamination. L' utilisation d' un distributeur de liquide de 8 x 12, 4 x 96 distribuer des gouttes de 2 pl chacune sur des plaques rectangulaires (figure 1 </strong>). Appuyez légèrement sur le bord de la plaque pour assurer la fusion de toutes les gouttes dans une mince feuille de liquide et couvrir immédiatement les plaques pour éviter l'exposition à la lumière. Pour assurer la dispersion des cellules très simple même, utiliser des plaques sèches, comme mentionné ci-dessus, et rapidement couvrir les plaques pour empêcher les cellules de la natation en réponse à la lumière. Maintenir le niveau des plaques couvertes et dans l'obscurité jusqu'à ce que tout le liquide soit absorbé. Placer les plaques sous une lampe UV germicide (30 watts tube UV germicide) pendant des périodes de temps déterminées de manière empirique pour obtenir un rendement optimal de mutants TS- parmi les survivants. Ici, les durées de 0,5 à 1,5 minutes à une distance de 40 – 50 cm à entraîner 90 à 99,9% de destruction. Survivants contiennent 100 – 1000 mutations ponctuelles induites par les UV, dont ~ 10% de changement des séquences codantes. Afin d'assurer une puissance maximale de l' irradiation UV avec aucune réversion due à l' ADN dépendant de la lumière réparer 11,12, le travail dans l'obscurité à cette étape et immédiatement emballer leplaques dans une boîte noire après l'irradiation. Garder les assiettes dans l'obscurité pendant 8-24 heures à la température ambiante. Placer les plaques dans un incubateur à 21 ° avec l'illumination pour former des colonies. La formation de colonies prend ~ 10 jours. Assurez-vous d'envelopper les plaques avec des sacs en plastique et ajouter du papier absorbant à l'intérieur pour éponger la condensation liquide. cycles d'évaporation et de condensation autrement peuvent fournir des voies de films liquides pour les contaminants de pénétrer dans les plaques. Chargez les plaques dans les piles concernées en tant que sources pour la cueillette des colonies robotique (Figure 2). Prélever des colonies pour 384-réseaux sur des plaques rectangulaires, et les cultiver à 21 ° C avec éclairage (~ 1 semaine). Condenser les 384 tableaux dans un 1536-réseaux (4: 1) en utilisant un robot réplique-placage (figure 3), et de permettre aux plaques de se développer pendant environ 3 jours à 21 ° C incubateur. Répliquer les 1.536-réseaux à deux plaques chacune et placer un dans le 21 ° C incubateur (permissivetempérature) et l'autre dans un incubateur à 33 ° C (température restrictive). Après 24 h, reproduire les plaques à 33 ° C à une nouvelle série de plaques préchauffées, et les placer dans les 33 ° C incubateur. NOTE: La raison de ce placage secondaire est que ts mutants létaux peuvent dans certains cas accumulent la biomasse importante, même si les cellules sont arrêtées au cours du premier cycle cellulaire après placage. La réplique secondaire élimine ce signal et augmente considérablement la sensibilité. Photographier les plaques avec un appareil photo numérique suivant 3 jours de croissance à 33 ° C et 5 jours de croissance à 21 ° C. Tenez les plaques dans un cadre fixe. Utilisez une "grille-plaque" marquée avec neuf indicateurs d'alignement qui est photographié avec les plaques de culture (figure 4). Photographie des plaques de culture comme alternative appariés 21 ° 33 ° C (21/33) images C et. NOTE: Les différents temps d'incubation sont utilisés pour égaliser la croissance depuis le type sauvage augmente de manière significativeplus rapidement à 33 ° C qu'à 21 ° C. 2. Identification des candidats mutants ts: Premier écran Traiter les paires 21/33 images de la plaque avec un Matlab logiciel d'analyse d'image personnalisée pour éliminer l'arrière-plan et de segmenter les images dans un 1536 tableau. Le programme détermine la biomasse détectée (intensité de pixels au total) dans chaque position (figure 5). REMARQUE: Le logiciel (fourni dans le SI avec les instructions) utiliseront l'image grille-plaque afin de déterminer les emplacements des cellules (entrées individuelles) dans un 1536-array à l'alignement d'agrandissement et de la plaque utilisée et calculer l'intensité de pixels au total dans chaque cellule . Ces valeurs pour chaque mutant sont ensuite comparés aux paramètres réglables pour déterminer la croissance requise à 21 ° C par rapport à un ts + standard et le degré de sensibilité à la température, définies comme suit: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), où S est le signal (pixeltensity après soustraction de fond), Mut est un mutant individuel, et "WT" est une colonie non-sensibles à la température choisie au hasard (souche mutagénisé qui avait ts + phénotype). Croissance à 21 ° C est défini comme S (Mut 21) / S (WT 21). Dans ce premier écran, appliquer des critères de sélection détendue (permettant une croissance relativement faible à 21 ° C et un degré de sensibilité à la température relativement faible) pour maintenir le faux négatif faible taux. Charger la liste des colonies sélectionnées générées par le logiciel comme un fichier d'instructions pour la seule colonie de la cueillette robotique (généralement dans un 384-array). Préparer les plaques de source et cible selon les instructions de la robotique et de choisir des colonies à matrice (figure 6). NOTE: pickers classiques nécessitent un fichier d'instructions dans un format, comme .csv, .txt, ou .xls. Tous les cueilleurs auront la capacité d'être entraînée fichier; différents formats nécessiteront des modifications mineures du code MATLAB (code source fourni). </li> Placez les plaques cibles dans le 21 ° C incubateur pour ~ 5 jours pour pousser une plaque de stock. 3. Identification ts Mutants: Deuxième écran Répétez l'étape 2.1 à retester colonies cueillies. Typiquement 30 – 50% des colonies va retester ts comme claires létaux, pour un rendement de 2% – 5% ts létaux par rapport aux colonies initiales survivants mutagenèse UV. Répétez l'étape 2.2 pour la cueillette des ts létaux deux fois dépistés, mais avec un fichier d'instruction modifié conçu pour les colonies de tableau en blocs de 100 colonies sur des plaques rectangulaires à 384 densité. Ceci est pour l'examen microscopique pratique dans l'étape suivante. Le format de fichier d'instruction est spécifié lors de l'exécution par le code MATLAB. Assurez-vous d'inclure plusieurs colonies WT comme un contrôle et placer les plaques à 21 ° C pendant ~ 5 jours. 4. Détermination phénotypique initiale Répliquer les plaques de 100 blocs disposés à l'étape 3.2 et les placer dans le 21 ° C incubator pour ~ 2 jours pour obtenir des colonies fraîchement croissance. Répliquer la nouvelle copie des plaques de 100 blocs (4.1) à trois exemplaires. Placer une copie dans l'incubateur à 21 ° C et une dans la couveuse 33 ° C en tant que témoins. Placez la troisième copie ( "screening plaques") dans une configuration robotique, et repérer les colonies avec de longues tiges touchées avec de l'eau stérilisée. NOTE: les cellules de Chlamydomonas épinglées agar robotically ont tendance à atterrir d'abord comme une tache assez dense de cellules, avec quelques cellules individuelles disponibles pour l'inspection microscopique. Afin d'optimiser les colonies pour l'inspection microscopique, repérer les cellules transférées initialement avec une goutte d'eau (le volume d'eau transféré par les longues broches robotiques est de ~ 100 nl). Il en résulte une dispersion des cellules dans un petit rayon (~ 1 mm) autour du centre de piégeage initial, avec de nombreuses cellules uniques isolées. Prendre photomicrographies d'une région de chaque tache des plaques de blindage au temps 0 (tout seul, des cellules non divisées) (La figure 7) et de placer les plaques à 33 ° C pendant l' incubation. Déterminer l'emplacement de l'image par la commande de l'étape manuelle d'un microscope tétrade de dissection modifié prévu pour donner des arrêts au 4,5 mm espacement d'un réseau de 384 densité de centre à centre. Retirez les plaques de blindage de la 33 ° C incubateur et prendre des photomicrographies, comme à l'étape 4.4, à des points de temps variables (10 h, 20 h, 48 h). Assurez-vous que la scène, le support de plaque, et le contrôleur de scène sont précisément calibrés pour obtenir des images des mêmes cellules dans chaque point de temps. Effectuer l'acquisition de microphotographie rapide (~ 10 min). Utilisez la deuxième copie dans le 33 ° C incubateur pour vérifier le phénotype ts et de faire en sorte que les variations de température au cours de l'acquisition d'image n'a aucun effet majeur sur ts phénotype. Analyser les images microscopiques et sélectionner des mutants sur la base des critères souhaités (figure 8). Repérez l'ensemble sélectionné finale dans une plaque de gélose 96 revêtu. Assurez-vous que chaquela plaque contient des mutants du même type d'accouplement et une résistance aux médicaments. Pour chaque plaque, incorporer les deux dernières colonnes, une (requête de mutation) positif et un négatif (WT) de contrôle pour le dosage de complémentation. 5. Test de complémentation et liaison des Nouveaux Mutants à "Frequent Flyers" Transfert de grandes quantités de colonies disposées à moyen gamète-induction exempt d' azote 10 dans microplaques de 96 puits (densité de chaque colonie devrait être d' environ 0,2 OD). Incuber les plaques sous lumière (13-20 W mercure des ampoules) pour ~ 5 h pour permettre la gamétogenèse. REMARQUE: Cette étape peut être réalisée soit avec une installation robotique réplication ou manuellement à l'aide d'un dispositif de placage simple. Suspendre les requêtes avec des mating types opposés hébergeant les cassettes de résistance alternatives dans des tubes avec le milieu d'induction gamète exempt d' azote 10 pour la gamétogenèse. Mélanger les échantillons dans une plaque cible dans un conjugué mixtele volume ure de 20 ul (figure 9). Après ~ 10 min sous la lumière, comptant 5 pi de chaque puits deux fois: une fois sur une plaque de TAP pour les essais de liaison et une fois sur TAP + 5 uM Paro + 9 uM Hygro pour les tests de complémentation. Incuber les plaques de liaison dans le 21 ° C incubateur pendant une nuit, puis les envelopper dans du papier. Gardez-les dans l'obscurité pendant 5 jours pour permettre la formation de zygospore. Incuber les plaques complémentation-test pour ~ 10 jours à la lumière à 21 ° C. REMARQUE: Les quantités de médicaments sont calibrés pour permettre la survie des diploïdes doublement hétérozygotes, mais ils sont encore assez pour éliminer les haploïdes d'accouplement. Ces montants ont été calibrés pour des intégrations de cassettes de résistance standards utilisés dans ce projet spécifique; avec de nouvelles intégrations, les doses doivent être recalibrés. La plupart de la biomasse est vérifié pour être diploïdes par cytométrie de flux (Figure 9), même si un niveau variable de haploïdes (probablement de la méiose et la croissance de doublement résistantségrégants) est habituellement observée aussi bien. Répliquer les plaques de complémentation-test en deux exemplaires pour l'identification du phénotype ts-. Placez une copie à 21 ° C et une copie à 33 ° C pendant ~ 5 jours. Colonies d'essai pour le phénotype ts-, tel que décrit dans la section 2.1 (Figure 5). Les colonies qui ne sont pas complémente avec la requête sont susceptibles de représenter des alleles du même gène que la requête (hétéro diploïdes de mutations alléliques dans le même gène). Pour les tests de liaison, après l'étape 5.4, déplacer les plaques arrière à la lumière pour permettre la méiose et excroissance de ségrégants haploïdes pendant ~ 7 jours. Répliquer plaques d'essai de liaison à TAP + 10 uM Paro et 10 uM Hygro pour sélectionner des descendances doubles résistant (prédites à 25% de la descendance haploïde, étant donné que les cassettes sont dissociées) et incuber à 21 ° C pendant une semaine. NOTE: Augmenter la dose de médicament pour haploïdes doublement résistantes. colonies de test pour le phénotype ts-, comme in étape 2.1. NOTE: Un phénotype ts- est prévu (et observé) des mutants dans le même groupe de complémentation que la requête. En outre, un phénotype ts- dans le dosage de liaison pour un mutant qui complète la requête, peut refléter lien étroit entre la requête et la nouvelle mutation. Mutants qui complètent les requêtes testées sont de nouveaux gènes susceptibles qui entreront dans le pipeline pour l'identification bioinformatique de la lésion responsable, et, finalement, pour une analyse phénotypique.