High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in<em> Chlamydomonas reinhardtii</em

1. UV Mutagenese Bereid een partij van 100-200 rechthoekige agarplaten met Tris-acetaat-fosfaat (TAP) gemiddeld 9,10. Bereid deze platen enkele dagen vóór en bewaar ze op de bank te drogen om snelle opname van de gesuspendeerde cellen te waarborgen in de volgende stappen. Cultuur Chlamydomonas cellen tot 0,2-0,5 optische dichtheid (OD 750; ~ 2 dagen) in 100 ml vloeibaar TAP onder licht bij 25 ° C en schudden bij 100 rpm. LET OP: UV-mutagenese wordt onafhankelijk uitgevoerd in twee genetische achtergronden: Mat- Hygro r (resistentie tegen hygromycine B) en Mat + Paro r (resistentie tegen Paromomycin). Antibioticum keuze arbitrair, mits de twee parende typen complementaire Geneesmiddel resistentie. Bekijk een monster van elk van de kweken onder de microscoop dat de cellen levensvatbaar en gezond (zwemmen en intact) en zonder vervuiling. LET OP: Overgrown culturen "crash" enverliest levensvatbaarheid, verschijnen als "geesten" in fase contrast microscopie. Bewaar geen shaker culturen gaan zodra ze verzadiging te bereiken. De "geest" fenomeen is gemakkelijk te detecteren in stap 1.3. Verdun de cultuur tot 0,003 OD 750. Wikkel de fles met aluminiumfolie homogene dichtheid te verzekeren, omdat de stam beweeglijke en zwemt directioneel in reactie op licht. Pas de dichtheid van de suspensie op basis van de geplande dosis UV, zodat goed voor celdoding, 200 – 600 zullen overlevende kolonies vormen op de platen (figuur 1). Zie tabel 1 voor informatie over UV-blootstelling tijden. Bevestig een kleine buis cassette die een vloeistof afgeefinrichting past en voeren een reeks wassingen voor sterilisatie volgens de instructies van de fabrikant, om verontreiniging te voorkomen. Met een doseerpomp 8 x 12, afzien 4 x 96 druppels 2 pi elk op rechthoekige platen (figuur 1 </strong>). Tik lichtjes aan de rand van de plaat de samenvoeging van druppels te verzekeren in een dunne laag vloeistof en meteen daarna de platen om de blootstelling aan licht. Zeer zelfs enkele cel verspreiding waarborgen, gebruik droge platen, zoals hierboven vermeld, en snel de plaques bedekken om te voorkomen dat de cellen van het zwemmen in reactie op licht. Houd het rekenbordjes niveau en in het donker totdat alle vocht is opgenomen. Plaats de platen onder een kiemdodende UV-lamp (30 watt kiemdodend UV buis) gedurende tijdsperioden empirisch bepaald om een ​​optimale opbrengst aan TS- mutanten tussen de overlevenden geven. Hier gebruiken tijden van 0,5-1,5 min bij een afstand van 40 – 50 cm leiden tot 90-99,9% doding. Overlevenden bevatten 100 – 1000 UV-geïnduceerde puntmutaties, waarvan ~ 10% mutatie coderende sequenties. Met het oog op maximale kracht van UV-bestraling geen terugkeer te verzekeren als gevolg van licht-afhankelijke DNA-reparatie 11,12, werken in het donker bij deze stap en meteen inpakkenplaten in een donkere doos na bestraling. Houd de platen in het donker gedurende 8-24 uur bij kamertemperatuur. Plaats de platen in een 21 ° C incubator met verlichting kolonies vormen. Kolonie formatie duurt ~ 10 dagen. Zorg ervoor dat de platen wrap met plastic zakken en voeg absorberend papier binnen te wissen vloeibaar condensatie. Verdamping en condensatie cycli anders vloeistoffilm routes voor verontreinigingen aan de platen voeren. Laad de platen in de desbetreffende stapels als bronnen voor robot kolonie picking (figuur 2). Pick kolonies 384-arrays op rechthoekige platen, en ze groeien bij 21 ° C met verlichting (~ 1 week). Condenseren 384-arrays in een 1536-arrays (4: 1) met een replica-plating robot (figuur 3), en laat de platen groeien ~ 3 dagen in de 21 ° C incubator. Een kopie van de 1536-arrays om twee platen elkaar en plaats een in de 21 ° C incubator (permissievetemperatuur) en de ander in een 33 ° C incubator (restrictieve temperatuur). Na 24 uur, een kopie van de platen in 33 ° C om een ​​nieuwe reeks van voorverwarmde borden en leg ze in de 33 ° C incubator. OPMERKING: De reden hiervoor is dat secundaire plating ts letale mutanten kan in sommige gevallen accumuleren aanzienlijke biomassa, zelfs wanneer de cellen worden aangehouden in de eerste celcyclus na uitplaten. De secundaire replica elimineert dit signaal en verhoogt de gevoeligheid. Fotograferen van de platen met een digitale camera na 3 dagen groei bij 33 ° C en 5 dagen kweek bij 21 ° C. Houd de platen in een vast frame. Gebruik een "raster-plate" gemerkt met negen alignment indicatoren die samen wordt gefotografeerd met de kweekplaten (figuur 4). Foto kweekplaten als afwisselende gepaarde 21 ° C en 33 ° C (21/33) beelden. OPMERKING: verschillende incubatietijden worden gebruikt om groei gelijk omdat de wildtype aanzienlijk groeitsneller bij 33 ° C dan bij 21 ° C. 2. Identificatie van de ts Mutant Kandidaten: eerste scherm Verwerk de gepaarde 21/33 plaat beelden met een aangepaste Matlab beeldanalyse software om de achtergrond en het segment van de afbeeldingen in een 1536-serie te elimineren. Het programma zal de gedetecteerde biomassa (totaal pixel intensiteit) in elke positie (figuur 5) te bepalen. LET OP: De software (meegeleverd in de SI samen met instructies) zal het de grid-plaat gebruiken om de locaties van cellen (individuele inzendingen) in een 1536-serie op de vergroting en de plaat alignment gebruikt te bepalen en te berekenen totale pixel intensiteit in elke cel . Deze waarden voor elke mutant worden vervolgens vergeleken met instelbare parameters om gewenste groei bepalen bij 21 ° C ten opzichte van een ts + standaard en de mate van temperatuur-gevoeligheid, gedefinieerd als: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), waarbij S signaal (pixelintensiteit na achtergrond aftrek), Mut een individuele mutant en "WT" is een willekeurig gekozen niet-temperatuurgevoelige kolonie (gemutageniseerde stam die ts + fenotype hadden). Groei bij 21 ° C wordt gedefinieerd als S (Mut 21) / S (WT 21). In dit eerste scherm, gelden relaxed selectiecriteria (waardoor een relatief lage groei bij 21 ° C en een relatief lage mate van temperatuurgevoeligheid) om de valse negatieve rente laag te houden. Laad de lijst van geselecteerde kolonies die door de software een instructie bestand voor de enkelvoudige kolonie picking robots (meestal in een 384-array). Bereid de bron en doel platen volgens de instructies robotica en kies kolonies array (figuur 6). LET OP: Conventionele plukkers vereisen een instructie-bestand in sommige formaat, zoals .csv, .txt of .xls. Alle plukkers zal de capaciteit hebben om bestand te zijn gedreven te hebben; verschillende formaten zullen kleine bewerking van de MATLAB-code (broncode) vereisen. </li> Leg het doel platen in de 21 ° C incubator voor ~ 5 dagen te groeien van een voorraad plaat. 3. Het identificeren van ts Mutants: Second Screen Herhaal stap 2.1 tot geplukt kolonies opnieuw te testen. Gewoonlijk 30 – 50% van de kolonies test opnieuw zo duidelijk ts letale mutaties, voor een opbrengst van 2% – 5% ts letale opzichte van aanvankelijke kolonies overleven UV mutagenese. Herhaal stap 2.2 voor het plukken van twee gescreende ts letale mutaties, maar met een gewijzigde instructiebestand ontworpen array kolonies in blokken van 100 kolonies op rechthoekige platen bij een 384-dichtheid. Dit is handig voor microscopisch onderzoek in de volgende stap. De instructie bestandsindeling wordt opgegeven tijdens runtime door de MATLAB-code. Zorg ervoor dat meerdere WT kolonies als controle omvatten en plaats de platen bij 21 ° C gedurende ~ 5 dagen. 4. Eerste Fenotype Bepaling Een kopie van de 100-blok platen bekleed met stap 3.2 en plaats ze in de 21 ° C Incubator voor ~ 2 dagen vers groeiende kolonies te verkrijgen. Een kopie van de nieuwe kopie van de 100-blok platen (4.1) tot drie exemplaren. Plaats een exemplaar in de 21 ° C incubator en een in de 33 ° C incubator als controle. Plaats de derde exemplaar ( "screening platen") in een robot setup, en ter plaatse de kolonies met lange pinnen aangeraakt met gesteriliseerd water. LET OP: Chlamydomonas cellen vastgemaakt aan agar robot hebben de neiging om in eerste instantie het land als een vrij dichte plek van cellen, met weinig enkele cellen beschikbaar voor microscopische inspectie. Voor het optimaliseren van de kolonies van de microscoop, spot het aanvankelijk overgedragen cellen met een druppel water (de hoeveelheid water overgebracht door de robot lange pennen ~ 100 nl). Dit leidt tot dispersie van de cellen in een kleine straal (~ 1 mm) over de eerste pinning centrum met veel geïsoleerde enkelvoudige cellen. Neem microfoto van een gebied van elke plek van de screening platen op tijdstip 0 (terwijl nog steeds single, onverdeelde cellen) (Figuur 7) en plaats de platen bij 33 ° C incuberen. Bepaal image locatie aan de handmatige fase controle van een gemodificeerde viertal dissectie microscoop ingesteld stopt bij de 4,5-mm hart op hart afstand van een 384-density matrix geven. Verwijder de screening platen uit de 33 ° C incubator en neem microfiches, zoals in stap 4.4, op verschillende tijdstippen (10 uur, 20 uur, 48 uur). Zorg ervoor dat het podium, de plaat houder, en het podium controller zijn nauwkeurig gekalibreerd om beelden van dezelfde cellen te krijgen in elk tijdstip. Voer snel photomicrograph acquisitie (~ 10 min). Gebruik het tweede exemplaar in de 33 ° C incubator naar de ts fenotype te verifiëren en om ervoor te zorgen dat de temperatuurschommelingen tijdens beeldacquisitie hebben geen grote invloed op ts fenotype. Analyseren microscopische afbeeldingen en selecteer mutanten op basis van de gewenste criteria (Figuur 8). Spot de laatste geselecteerde set in een 96-array agar plaat. Zorg ervoor dat elkeplaat bevat mutanten van hetzelfde type paring en resistentie tegen geneesmiddelen. Voor elke plaat, voorzien van de laatste twee kolommen een positieve (vraag mutatie) en een negatieve (WT) controle voor de complementatie assay. 5. Complementatie en scharniermechanisme Testen van New Mutants aan "Frequent Flyer" Transfer grote hoeveelheden van de array kolonies stikstofvrije gameet-inductiemedium 10 in 96 putjes microplaten (dichtheid van elke kolonie duurt ongeveer 0,2 OD). Incubeer de platen onder licht (13-20 W kwik lampen) voor ~ 5 uur tot gametogenese mogelijk te maken. LET OP: Deze stap kan worden uitgevoerd ofwel met een repliceren robot setup of handmatig met een eenvoudige plating apparaat. Opschorten queries met de andere voortplantingstypes het herbergen van de alternatieve weerstand cassettes in buizen met stikstof-vrije gameet-inductie medium 10 voor gametogenese. Meng de monsters in een doel plaat in een paring mixture volume van 20 pl (figuur 9). Na ~ 10 min onder het licht, spot 5 ul van elk putje twee keer: een keer op een TAP plaat voor koppeling testen en eenmaal op TAP + 5 uM Paro + 9 uM Hygro voor complementatie testen. Incubeer de koppeling platen in de 21 ° C incubator 's nachts, en vervolgens wikkel ze in folie. Houd ze in het donker gedurende 5 dagen om zygospore vorming mogelijk te maken. Incubeer complementatie-testplaten voor ~ 10 dagen in het donker staan ​​bij 21 ° C. OPMERKING: De drug bedragen zijn afgestemd op overleving dubbel heterozygote diploïde mogelijk, maar nog voldoende om de dekking haploïden elimineren. Deze bedragen werden gekalibreerd voor standaard weerstand cassette integraties die in dit specifieke project; met nieuwe integraties, moet de dosis opnieuw worden gekalibreerd. De meeste biomassa wordt geverifieerd diploïde met flowcytometrie (Figuur 9), hoewel voor variërende haploïden (waarschijnlijk van meiose en groei dubbel resistentesegreganten) wordt meestal waargenomen ook. Repliceren de-complementering testen platen in twee exemplaren voor de TS-fenotype identificatie. Plaats een kopie bij 21 ° C en een kopie bij 33 ° C gedurende ~ 5 dagen. Test kolonies voor de TS-fenotype, zoals beschreven in paragraaf 2.1 (Figuur 5). Kolonies die geen aanvulling met de vraag vertegenwoordigen waarschijnlijk allelen van hetzelfde gen als de query (diploïden hetero-allelische mutaties in hetzelfde gen). Voor koppeling testen, volgende stap 5.4, verschuiven de borden terug aan het licht meiose en uitgroei van haploid segreganten voor ~ 7 dagen mogelijk te maken. Repliceren koppeling testplaten TAP + 10 pM en 10 pM Paro Hygro selecteren voor dubbele resistente nakomelingen (voorspelde 25% van de haploïde nageslacht, aangezien de cassettes gekoppelde) en incubeer bij 21 ° C gedurende een week. OPMERKING: Verhoging van de drug dosering voor dubbel resistente haploïden. Test kolonies voor de TS-fenotype, zoals ikn stap 2.1. LET OP: Een TS-fenotype wordt verwacht (en waargenomen) voor mutanten in dezelfde complementatie groep als de query. Daarnaast is een TS-fenotype in de binding assay, een mutant die de query aanvult, kan vast verband tussen de query en de nieuwe mutatie weerspiegelen. Mutanten die de geteste query aanvulling waarschijnlijk nieuwe genen die de pijpleiding bioinformatic identificatie van de veroorzakende laesie voor verdere fenotypische analyse voeren en uiteindelijk.