عالية الإنتاجية آليا عزل بمساعدة من درجة الحرارة التي تراعي القاتلة المسوخ في<em> كلاميدوموناس reinhardtii</em
Summary
Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.
Abstract
Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.
Introduction
التوصيف المظهري من مجموعات متحولة منهجي من الكائنات النموذج هو نهج ثبت لتشريح تعقيد الخلوية. وفرداني وحيدة الخلية الخضراء الطحالب كلاميدوموناس reinhardtii يحتوي على مجموعة الجينات مثل النباتات، لكنها اختلفت من النباتات البرية قبل الازدواجية الجينوم متعددة في النسب نبات الأرض 2. من حيث المبدأ، وعدم الازدواجية الجينات ودورة الحياة أساسا فرداني يسهل إلى حد كبير النهج الوراثية الخسارة من وظيفة. ومع ذلك، واختلال الموجهة للجينات من الاهتمام يكاد يكون من المستحيل نظرا لعدم وجود كفاءة التكامل الجيني مثلي. مكتبة تعطل إقحامي عشوائية قيد الإنشاء، جنبا إلى جنب مع تحديد الموقع تعطلت، مما أسفر حتى الآن مجموعة العريض من 1،935 اضطرابات معين يمثل 1،562 الجينات 3. ومع ذلك، فإن هذا النهج (من المتوقع في عام لإنتاج طفرات فارغة) لا ينطبق على الجينات الأساسية. درجات الحرارة الحساسة (TS) الطفرات يمكن recovereد في الجينات الأساسية، والطرق الحديثة تسمح تحديد كفاءة من هذا الجين المتحور والآفة المسببة. تحليل المظهري في درجة حرارة عالية ثم يقدم معلومات فورية حول وظيفة الجين المتحور. وذكرت لنا على عزل وتوصيف الطفرات المميتة TS في ~ 70 جينات أساسية في كلاميدوموناس، مع التركيز بصفة خاصة على الجينات المسؤولة عن تقدم دورة الخلية والسيطرة على 1،4.
وكانت شاشات المميتة نهاية الخبر الدعامة الأساسية للتحليل الجيني في الكائنات الحية الدقيقة لعقود 5،6. من حيث المبدأ، وهذه سمة مرغوب فيه هو نهج "التشبع"، وهذا يعني أن كل الجينات قادرة على التحور إلى تضمنته الفتك يتم تحديدها من قبل متحولة واحد على الأقل، مما يسمح للتحليل كامل. ومع ذلك، في الواقع، هناك عدة عوامل تحد من نهج إلى التشبع. أولا، في حين أن جميع الجينات تقريبا يمكن أن تحور إلى فقدان النشاط في درجة حرارة عالية، وكفاءة استرداد هذه المسوخ تختلف باختلاف ما لا يقل عنأمر من حجم 7،8. لذلك، تبدأ شاشة عشوائية لالتقاط الزيارات المتكررة في "المسافرين الدائمين" قبل فترة طويلة واقترب التشبع. ثانيا، في حين نهاية الخبر الطفرات عادة ما تؤدي إلى الحد من وظيفة، فإنها قد لا تكون بلا قيم حقيقية في درجة حرارة المقيدة (وعلى العكس، هي في كثير من الأحيان لا تعمل بكامل طاقتها في درجة الحرارة المسموح بها). يمكن التعامل مع هذه المشكلة إلى حد ما مقارنة الأليلات متعددة؛ إذا كانت كل مشاركة النمط الظاهري مشترك، وهذا هو الأرجح أن تعكس نتيجة لتعطيل بسيط من الجين. الأليلات متعددة قد تكون مفيدة أيضا للغاية لتحديد الجزيئي نهائي الآفة المسببة 1. ومع ذلك، فإن "المسافر الدائم" المشكلة يعني أن الأليلات متعددة في الجينات نادرا ما تصيب يمكن أن يكون من الصعب التعافي.
لهذه الأسباب، لقد تم تطوير خط أنابيب معززة لعزل وتوصيف المسوخ نهاية الخبر ظاهريا. لقد جمعنا أكثر من 3،000 نهاية الخبر المسوخ حتى الآن، طالتسبب حوالي 200 الطفرات دورة الخلية مرشح جديدة. التحليل الجزيئي والمظهرية لهذه المجموعة، والتي من المرجح بالفعل تشمل الطفرات في معظم أو جميع مسارات الخلية الأساسية، ينبغي أن تقدم رؤى ونظريات جديدة في علم الأحياء الخلية النباتية. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذا الخط إلى أي الكائنات الحية الدقيقة التي تنمو على أجار لبناء بكفاءة نهاية الخبر مجموعات متحولة.
مذكرة بشأن المعدات: اثنين من الروبوتات هي مهمة جدا لتحقيق الكفاءة في هذا الإجراء (منقار مستعمرة ومجموعة متماثلة منقار بلاتر / الكرز). جامعي وعادة ما يكون المسامير المعدنية. وتعقد المستعمرات التقطت في الهواء على هذه المسامير لفترة (ثواني إلى دقائق، اعتمادا على نموذج). يموت كلاميدوموناس في حوالي 20 ثانية على مسمار معدني في الهواء. هذا يقيد اختيار نموذج للكائن. المسائل دقة. لدينا منقار مستعمرة دقيقة إلى حد معقول. ومع ذلك، فمن عنيفة بعض الشيء في عملها وبعض إمكانية لانتقال التلوث القائم على الرش. لم يتم استخدامه على ارتفاعإيه من 384 الكثافة (4.5 ملم تباعد مركز الوسط)؛ في هذه الكثافة، ودقة مقبولة تماما. واختيار الروبوت الطلاء طبق الأصل / الكرز (التجهيزات المختلفة المستخدمة لهذه التطبيقات) أبطأ بكثير في قطف، ولكن ليس دقيقا بما فيه الكفاية لكثافة 1536 (6144 يشكل تحديا، وحتى بالنسبة لهذا الروبوت دقيقة للغاية، ونحن قمنا بتقييم هذه الكثافة ولكن لم يتم انتخاب لاستخدامه بسبب الصعوبات التي تواجهها مختلف). الروبوت سوف لا تعمل بشكل جيد إذا تم تحميلها لوحات بشكل غير متساو، وما إلى ذلك. ومن المهم أن بقعة تحقق للتأكد من أن الأمور في نصابها الصحيح تحدث. وبطبيعة الحال، سيتم تشغيل الروبوت غير المراقب وبشكل عام، كل سوف تسير على ما يرام إذا كانت لوحات القليلة الأولى الصحيحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
خط أنابيب الموصوفة هنا لعزل عالية الغلة من المسوخ المميتة TS يضمن أن يفترض كل مسارات الخلوية ضرورية للجينوم كلاميدوموناس ممثلة. خطوتين الأكثر أهمية بالنسبة لمجموعة فعالة من الجينات دورة الخلية المحتملة وللقضاء على الأليلات المتكررة "المسافر الدائم" هي: 1) تعريف متماسك من خصائص النمط الظاهري اعتقال لدورات الخلايا غير مكتملة و2) فحص تكامل مواز ضد تحديدها بالفعل الاستعلام الجينات لتكبير جمع بأخرى معزولة حديثا.
عندما متزامنة عبر الدوائر السوداء الخفيفة، كلاميدوموناس ينمو الضوئي خلال ساعات النهار وزيادة في حجم الخلية> 10X دون أي تكرار الحمض النووي أو خلية تقسيم 13. تتزامن تقريبا مع بداية الليل، وخلايا ثم الخضوع لدورات متعددة بالتناوب تكرار الحمض النووي، الانقسام، وانقسام الخلايا (الشكل 8). هذا schem التنظيمييوفر البريد التمييز الطبيعي بين الجينات المطلوبة في المقام الأول لنمو الخلايا والنزاهة والجينات المطلوبة خصيصا للدورة انقسام الخلايا. وجدنا أن 10 ساعة و20 ساعة نقطة زمنية هي مفيدة للغاية لالمظهرية الخام الأولية قطع 1. لفئات واسعة من طفرات مميتة TS أن ندرك في الوقت الراهن، على أساس هذه الصور (انظر SI في تولين والصليب، 2014) 1، هي: الشق، الفشار، جولة، الصغيرة والمتوسطة، تحلل في وقت مبكر، ومتعددة دورة (الشكل 8 ).
الفئات الثلاث الأكثر أهمية التي نركز عليها هي الشق، الفشار، وجولة. عرضت على "الشق" والظواهر "الفشار" في السابق أن تكون سمة من سمات معظم الآفات خلية دورة محددة (على سبيل المثال، الإنقسامية التي تعتمد على السيكلين كيناز، والآلات تكرار الحمض النووي، وTopoisomerase الثاني) 1. مظهر واحد (الشق) أو متعددة (الفشار) طائرات واضحة من انقسام الخلايا بدايته ولكن غير ناجحة هو morphol مريحةمؤشر ogical من بدء دورة الخلية. هذه المسوخ المعرض عموما عيوب نمو ضئيلة أو معدومة، مع زيادة في حجم الخلايا مماثلة لWT على علامة 10 ساعة. والشق والفشار الظواهر واضحة في 10 ساعة ويتم تطويرها بالكامل (كثيرا ما يرتبط مع تحلل الخلايا) بواقع 20 ساعة. خلايا "جولة" تنمو على نحو مماثل لWT لكن مع إنتاج خفضت كثيرا من الطائرات تقسيم بدايته واضحة، وبالتالي العوائد الكبيرة، وخلايا القبض الجولة. وتراجعت المسوخ السابقة في هذه الفئة إلى مكونات معقدة 14 أو في الجينات الداعمة للطور الصعود المطلوبة لوظيفة أنيبيب (العوامل المساعدة للطي تويولين، جاما تويولين حلقة مجمع) 1. في أوقات لاحقة، وهذه الخلايا غالبا ما تظهر تحلل الخلايا وضوحا.
"الصغيرة" وخلايا "متوسطة" تنمو إما تكاد لا تذكر (الصغيرة) أو أقل بكثير من وزن (وسط). العديد من هذه المسوخ التي تم تحديدها حتى الآن لديهم آفات في الجينات التي تشير إلى الأدوار في cellula الأساسي الشروحعمليات النمو ص (الترجمة أو نشوء حيوي الغشاء). التمييز المجهري الرئيسي بين المتوسطة وجولة يعتمد على مقدار النمو في 10 ساعة (جولة: مثل WT، المتوسطة: انخفاض). لأن الفئات الصغيرة والمتوسطة هي كبيرة جدا وربما تعكس الآفات في مجموعة كبيرة من مسارات الخلوية، نحن لسنا في محاولة لتشبع هذه الفئات. ومع ذلك، فإننا لا نريد أن جزيئيا تحديد ممثلي الطبقة لفهم الظواهر الخسارة في مسارات متنوعة. فئتين غير مدروسة هي: 1) المسوخ التي تفقد سلامة (فقدان اللون الأخضر، وفقدان refractility) من قبل علامة 10 ساعة، مع القليل من الأدلة على نمو الخلايا مسبق و2) دورات متعددة الناشر في وقت مبكر. خلايا تتكاثر على نحو مماثل لWT في 10 و 20 ساعة، على الرغم من أنها تظهر عجزا كاملا لتنفيذ الانتشار على المدى الطويل.
نحن تميز معظمها "من الدرجة الأولى"، "الفشار"، و "جولة" واستبعاد خلايا صغيرة مدورة والمتوسطة، وكذلككما المسوخ تتسرب منها المياه التي كاملة القليلة انقسامات الخلية. هذا هو أساسا لضمان ميزات الخلوية الأساسية، مثل النمو وسلامة الغشاء، وظيفية، وإثراء احتمال لالجينات ذات الصلة الانقسام. تم العثور على هذا النهج لتكون فعالة تجريبيا. ومع ذلك، قد يكون هذا الجين دورة الخلية هو عديد المظاهر ولها أدوار إضافية في وقت سابق من G1، قبل التقسيم الفعلي. مثل هذه الحالات، والتي نتوقع أن تكون نادرة، وغاب. أكثر عموما، ونحن نهدف لاعتقال متجانسة، وهذا احتمال كبير ويرجع ذلك إلى واحد الطفرة المسببة هذا هو بروتين مختلة تماما. ومع ذلك، لنفس السبب كما هو موضح فقط، قد يكون هناك عدة نقاط اعتقال وبالتالي، بعض المرونة من المستحسن في اختيار المرشحين.
من أجل إثراء مجموعة مع الجينات التي تم تشخيصها حديثا، ويعاير المرشحين الذي تم اختياره لتكامل. نحن بحاجة ts- في السيطرة الايجابية (الاستعلام ضد طفرة الاستعلام) ونهاية الخبر + في السيطرة السلبية (QUERذ ضد WT). طفرات جديدة في مجموعة تكامل نفس الاستعلام هي ts-. العضوية في مجموعة تكامل نفس يعكس دائما تقريبا آفة الجزيئية في نفس الجين (وقد كان هذا هو الحال بالنسبة لكل هذا الجين اختبرناها). لذلك، ل "المسافرين الدائمين"، هذا المعيار هو الإقصائي لمزيد من التوصيف. المسوخ التي لم تكن في مجموعة تكامل نفس الاستفسارات اختبار المرشحة للجينات جديدة وتتميز مزيد من المعلومات البيولوجية والأدوات التجريبية. انتعاش متغير بدرجة كبيرة من ts- الأليلات إلى مجموعات مختلفة تكامل ظاهرة التي تعرف جيدا هو، وتقلب أكبر بشكل ملحوظ من الضوضاء بواسون، وذلك بسبب تقلب جوهري كبير من التحولية لts- بين جينات مختلفة. يسبب يمكن أن تشمل الاختلافات الجوهرية thermolability. أحجام البروتين مختلفة؛ وجود البروتين ومونومر مقابل كما كبيرة، استقر المجمع. والبقع الساخنة تسبب الطفرات الوراثية. هذا هو تقريبا nuisa النقيالامتحانات التنافسية الوطنية. ومع ذلك، وينتج نتيجة إيجابية هي أن "المسافر الدائم" القائمة ليست طويلة (مع فقط بضعة أهداف الاحتلال أكثر من القائمة)، وبالتالي فإن اختبار تكامل كثيفة العمالة ليست مهمة ضخمة حتى مراحل لاحقة من المشروع.
كما اتباع نهج متكامل، أجرينا فحص الربط. في هذا الاختبار، يتم اختيار السلالات المقاومة للازدواجية ويتم اختبارها لالنمط الظاهري ts-. ومن المتوقع النمط الظاهري ts- (ولاحظ) عن المسوخ في مجموعة تكامل نفس الاستعلام أو طفرات مرتبطة بإحكام. لكل من الجينات اختبار، ومن المتوقع أن تظهر (TS + النمط الظاهري) في احتمال معينة اعتمادا على المسافة الوراثية ذرية WT. ونحن نقدر أن هناك حوالي 100 zygospores لكل التزاوج في هذه البقع. على افتراض 100٪ كفاءة الانتصافي، وهذا سوف يؤدي إلى ذرية مقاومة للالمزدوج المخدرات حوالي 100 من أشرطة مقاومة العقاقير غير المرتبطة (25٪ من ذرية الانتصافي، أربعة في الانقسام الاختزالي، بسبب Mالميراث endelian). وهذا من شأنه أيضا أن تكون الحال بالنسبة ts- الطفرات، حيث 25٪ من السلالات ستكون مزدوجة متحولة، وسوف يكون 25٪ WT إذا كان الاستعلام واختبار الطفرات غير المرتبطة. لذلك، من ذرية-مقاومة مزدوجة من المخدرات، و25٪ يكون وزن (حوالي 25 خلية). هذا هو الحال بالنسبة لطفرات غير المرتبطة تماما. ومع ذلك، الربط المعتدل (داخل ~ 20 سم، حوالي 2 ميغابايت، أو 2٪ من الجينوم 115) سوف يقلل بشدة أو القضاء على الخبر + إشارة. في حالة الربط بين الطفرة اختبار لالكاسيت المضادات الحيوية، واتس + haploids التي هي مزدوجة المقاوم للعقاقير موجودة في كميات منخفضة جدا. هذا يظهر كما فشل واضح لإعادة تجميع مع كل المسوخ اختبارها، وعلى الرغم من استكمال جميع المسوخ اختبارها، وهي نتيجة الشاذة أن يلاحظ بسهولة. في مثل هذه الحالات، سوف backcrossing يحل المشكلة.
كلا من المعرفة المسبقة ومن تحليل تسلسل، فإننا نتوقع الجينات دورة الخلية في كلاميدوموناس الى نحو 500 جين 2، على الرغم من موشارع، ولكن ربما ليس كل شيء، ضرورية. سنقيم ضرورة لجولات الطفرات إضافية كما يتم جمع المزيد من المسوخ ومستوى ارتفاع التشبع.
تم تصميم هذا الإجراء بشكل فريد لدراسة العمليات البيولوجية الأساسية والجينات والبروتينات التي تحمل بها. منهجيات أخرى لتوليد اضطرابات في الجينات الأساسية موجودة (على سبيل المثال، والتحول من الأليلات mutagenized عشوائيا 16، الأليلات كتب مشروط 17، أو الأليلات hypomorphic 18). ومع ذلك، فإنها كلها تتطلب إعادة التركيب مثلي، التي قمعت بقوة في الخضري كلاميدوموناس. متفاوت المسافات، interspaced بانتظام تكرار المتناوب قصيرة (كريسبر) / تم تأسيس نظام Cas9 كأداة قوية لتعديل الجينات 19. ومع ذلك، فإنه حتى الآن للعمل بكفاءة في كلاميدوموناس 20. الأهم من ذلك، كل من هذه الأساليب تتطلب معرفة مسبقة من الهدف. هذا هو تقييد شديدإذا كان أحد يرغب في أن تتاح الفرصة لتعلم شيء جديد! ونهجنا تسفر عن الطفرات تحديد الجينات الأساسية، مستقلة عن أي معرفة مسبقة. لذلك، على المستوى الحالي للتكنولوجيا، قد يكون عزل الطفرات العشوائية نهاية الخبر تليها تحديد الجينات التي كتبها تسلسل عميق الطريقة الأكثر فعالية لكسب الدخول السريع في بيولوجيا الخلايا الميكروبية في superkingdom النبات.
تحديد الطفرات المسببة (من بين 100 ~ الترميز تسلسل تغيير الطفرات في كل استنساخ) هو خارج نطاق هذه الورقة. تسلسل عميق حمامات المعزول متضخم 1 فعالا لكنه يحتاج إلى عمالة كثيفة. استراتيجية تجمع اندماجي لتحديد جميع الطفرات في عدد كبير من السلالات، وبعد تسلسل عدد قليل من برك، هو من حيث التكلفة وفعالة جدا والعمل. استراتيجية جديدة لاندماجي التسلسل المعزول متضخم قيد التطوير التي من شأنها أن تسمح بتحديد الطفرات المسببة في العشرات من المسوخ سيمultaneously في تشغيل تسلسل واحد (قيد الإعداد). هذه الكفاءات هي مهمة جدا للسماح للخطوة تحديد الجينات الهامة لمواكبة التراكم السريع جدا من المسوخ التي أصبحت ممكنة بفضل الإجراءات الموضحة هنا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء المختبر عبر للحصول على المشورة ومناقشة مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل خدمات الصحة العمومية 5RO1-GM078153 و جائزة زميل جديد من مؤسسة سيمونز لميكال Breker.
Materials
| Equipment: | |||
| Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
| MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
| Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |
References
- Tulin, F., Cross, F. R. A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom. Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).
- Cross, F. R., Umen, J. G. The Chlamydomonas cell cycle. Plant J. 82, 370-392 (2015).
- Li, X., et al. An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 28, 367-387 (2016).
- Tulin, F., Cross, F. R. Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas. Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).
- Simchen, G. Cell cycle mutants. Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).
- Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast. I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell. 30, 248-258 (2008).
- Harris, E. . The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).
- Dutcher, S. K. Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).
- Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations. Sci World J. 2015, 250158 (2015).
- Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).
- Francis, D. Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32. Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).
- Zachariae, W., Nasmyth, K. Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex. Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).
- Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318, 245-250 (2007).
- Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).
- Mnaimneh, S., et al. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).
