Summary

Визуальное ткани интерреналовой стероидогенных и его сосудистой микросреду в данио рерио

Published: December 21, 2016
doi:

Summary

Интерреналовой железа в данио является костистых аналогом млекопитающих надпочечника. Этот протокол представляет , как выполнить 3-β-гидроксистероиддегидрогеназы (Δ 5-4 изомеразный; 3β-HSD) ферментативной активности анализа, который обнаруживает дифференцированные стероидогенеза клеток в развивающихся данио рерио.

Abstract

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

Introduction

Надпочечники, важнейшим компонентом гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, секретирует стероиды и координирует стероидный гомеостаз и телесную реакцию на стресс. Надпочечники включает внешнюю кору, которая секретирует стероиды в манере зоны специфичную и внутренние мозговое вещество, которое синтезирует катехоламины. Интерреналовой железы у костистых рыб является аналогом надпочечников у млекопитающих и состоит из стероидогенных интерреналовой и хромафинных клеток, которые являются функциональными аналогами коры надпочечников и мозгового вещества соответственно 1-3. Исследования , проведенные с использованием модели данио сообщили , что оба стероидогенных и Хромаффинные клеточных клонов формируются молекулярных и клеточных механизмов , весьма напоминающих те , у млекопитающих 1,2. Поэтому данио является потенциально мощной моделью для изучения генетических заболеваний, контроля нейроэндокринной и систем биологии гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (интерреналовой) оси.

<p class = "jove_content"> В надпочечниках, 3β-HSD катализирует превращение прогестерона из прегненолона, 17 & alpha ; -гидроксипрогестерона от 17 & hydroxypregnelolone и андростендион из дегидроэпиандростерона 4,5. 3β-HSD имеет важное значение для биосинтеза всех классов гормональных стероидов, а именно, прогестерон, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, андрогены и эстрогены. Два человеческого 3β-HSD изоферментов HSD3B1 и HSD3B2 дифференцированно выражены 6. HSD3B1 выражается в плаценте и периферических тканях, тогда как HSD3B2 выражается в коре надпочечников и гонад. Человек HSD3B1 и HSD3B2 являются со-ортологи данио hsd3b1, которая выражается в интерреналовой ткани и взрослых гонад; данио hsd3b2 является материнским выразил ген, транскрипты исчезнуть до органогенеза 7. Протокол 3β-HSD ферментативного анализа всего монтажа активности для данио был разработан путем модификации метода Леви, Aы описывается Milano и др. , На замороженных срезов восьми видов костистых 8. Из-за тканевой проницаемости и оптической прозрачности развивающихся данио, в целом монтажа 3β-HSD гистохимия может быть успешно использован для фиксированного данио эмбрионов и личинок и конкретно очертить дифференцированные интерреналовой ткани.

Этот чувствительный и быстрый анализ был применен к различным мутантами и морфантов, демонстрирующих различные типы интерреналовой дисморфогенеза. Интерреналовой активность 3β-HSD отсутствует в зародыше , где спецификация интерреналовой ткани нарушается через специфический нокдаун фактора транскрипции Ff1b и уменьшается как интерреналовой дифференциация влияет на нокдауна Ff1b coregulator Prox1 9,10. Следует отметить, что активность 3β-HSD могут быть обнаружены у мутантов с тяжелыми дефектами на ранних стадиях развития , такие , как одноглазый булавочной головки и косоглазие, где 3β-Hсд гистохимия очерчивает как миграция интерреналовой клеток влияет 11. Дифференцировка интерреналовой ткани не будет нарушена даже при полном отсутствии крови и сосудистой сети. Поэтому, как эндотелием сигналы формируют развивающийся интерреналовой орган может быть определено 12,13. В целом, этот гистохимических анализ был успешно использован для изучения спецификации, дифференцировки и миграции стероидогенных клеток в данио модели. Таким образом, оно должно быть эффективным и надежным инструментом для любых генетических или химических экранов, ориентированных на надпочечники и интерреналовой расстройства органов.

Protocol

Заявление по этике: Все экспериментальные процедуры по данио были утверждены Институциональный животных по уходу и использованию комитета Tunghai университета по (IRB одобрение NO 101-12.) И осуществляется в соответствии с утвержденными руководящими принципами. 1. Исходные раст?…

Representative Results

Для того, чтобы определить , как стероидогенных codevelops интерреналовой ткани с pronephric клубочков почек и его нарождающейся сосудистую систему , анализ ферментативной активности 3β-HSD была выполнена на двойном трансгенной Tg (wt1b: GFP) li1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 эмбрионов …

Discussion

Сила сигнала активности 3β-HSD увеличилось в течение реакции. Четкие сигналы активности 3β-HSD были обнаружены после 4 часов реакции на стадии с 28 часов после оплодотворения и далее. Тем не менее, продолжительность реакции требует эмпирического определения, в зависимости от цели анализа. В …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим профессора Кристофа Englert и профессор Didier Stainier для подарив Т.Г. (wt1b: GFP) li1 и Tg (kdrl: EGFP) s843 штаммы, соответственно, и Тайвань рерио Основной фонд для обеспечения Tg (kdrl: mCherry) CI5. Это исследование было поддержано грантами Министерства Тайваня по науке и технике (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).

Materials

Confocal microscope Carl Zeiss  LSM510 
DMSO Sigma D8418 
Glycerol USB US16374
Hyclone Fetal Calf Serum  GE Healthcare Life Sciences SH30073
Nicotinamide Sigma N0636
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate Sigma N1636
4-Nitro blue tetrazolium Promega S380C
Nusieve GTG Lonza 50081
Paraformaldehyde Sigma P6148
Phenylthiourea Sigma  P7629
Phosphate buffered saline Sigma P4417-100Tab
PYREX Spot Plate Corning 7220-85
Reef Salt AZOO AZ28001
trans-Dehydroandrosterone Sigma D4000
Triton X-100 Sigma T8787
Tween 20 Sigma P9416
Vibratome Leica VT1000M

References

  1. Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
  2. To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
  3. Liu, Y. W. Interrenal organogenesis in the zebrafish model. Organogenesis. 3, 44-48 (2007).
  4. Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
  5. Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
  6. Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
  7. Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
  8. Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
  9. Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
  10. Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
  11. Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
  12. Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
  13. Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
  14. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  15. Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
  16. Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
  17. Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
  18. Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).

Play Video

Cite This Article
Chou, C., Lin, J., Hou, H., Liu, Y. Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish. J. Vis. Exp. (118), e54820, doi:10.3791/54820 (2016).

View Video