Интерреналовой железа в данио является костистых аналогом млекопитающих надпочечника. Этот протокол представляет , как выполнить 3-β-гидроксистероиддегидрогеназы (Δ 5-4 изомеразный; 3β-HSD) ферментативной активности анализа, который обнаруживает дифференцированные стероидогенеза клеток в развивающихся данио рерио.
This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.
Надпочечники, важнейшим компонентом гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, секретирует стероиды и координирует стероидный гомеостаз и телесную реакцию на стресс. Надпочечники включает внешнюю кору, которая секретирует стероиды в манере зоны специфичную и внутренние мозговое вещество, которое синтезирует катехоламины. Интерреналовой железы у костистых рыб является аналогом надпочечников у млекопитающих и состоит из стероидогенных интерреналовой и хромафинных клеток, которые являются функциональными аналогами коры надпочечников и мозгового вещества соответственно 1-3. Исследования , проведенные с использованием модели данио сообщили , что оба стероидогенных и Хромаффинные клеточных клонов формируются молекулярных и клеточных механизмов , весьма напоминающих те , у млекопитающих 1,2. Поэтому данио является потенциально мощной моделью для изучения генетических заболеваний, контроля нейроэндокринной и систем биологии гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (интерреналовой) оси.
<p class = "jove_content"> В надпочечниках, 3β-HSD катализирует превращение прогестерона из прегненолона, 17 & alpha ; -гидроксипрогестерона от 17 & hydroxypregnelolone и андростендион из дегидроэпиандростерона 4,5. 3β-HSD имеет важное значение для биосинтеза всех классов гормональных стероидов, а именно, прогестерон, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, андрогены и эстрогены. Два человеческого 3β-HSD изоферментов HSD3B1 и HSD3B2 дифференцированно выражены 6. HSD3B1 выражается в плаценте и периферических тканях, тогда как HSD3B2 выражается в коре надпочечников и гонад. Человек HSD3B1 и HSD3B2 являются со-ортологи данио hsd3b1, которая выражается в интерреналовой ткани и взрослых гонад; данио hsd3b2 является материнским выразил ген, транскрипты исчезнуть до органогенеза 7. Протокол 3β-HSD ферментативного анализа всего монтажа активности для данио был разработан путем модификации метода Леви, Aы описывается Milano и др. , На замороженных срезов восьми видов костистых 8. Из-за тканевой проницаемости и оптической прозрачности развивающихся данио, в целом монтажа 3β-HSD гистохимия может быть успешно использован для фиксированного данио эмбрионов и личинок и конкретно очертить дифференцированные интерреналовой ткани.Этот чувствительный и быстрый анализ был применен к различным мутантами и морфантов, демонстрирующих различные типы интерреналовой дисморфогенеза. Интерреналовой активность 3β-HSD отсутствует в зародыше , где спецификация интерреналовой ткани нарушается через специфический нокдаун фактора транскрипции Ff1b и уменьшается как интерреналовой дифференциация влияет на нокдауна Ff1b coregulator Prox1 9,10. Следует отметить, что активность 3β-HSD могут быть обнаружены у мутантов с тяжелыми дефектами на ранних стадиях развития , такие , как одноглазый булавочной головки и косоглазие, где 3β-Hсд гистохимия очерчивает как миграция интерреналовой клеток влияет 11. Дифференцировка интерреналовой ткани не будет нарушена даже при полном отсутствии крови и сосудистой сети. Поэтому, как эндотелием сигналы формируют развивающийся интерреналовой орган может быть определено 12,13. В целом, этот гистохимических анализ был успешно использован для изучения спецификации, дифференцировки и миграции стероидогенных клеток в данио модели. Таким образом, оно должно быть эффективным и надежным инструментом для любых генетических или химических экранов, ориентированных на надпочечники и интерреналовой расстройства органов.
Сила сигнала активности 3β-HSD увеличилось в течение реакции. Четкие сигналы активности 3β-HSD были обнаружены после 4 часов реакции на стадии с 28 часов после оплодотворения и далее. Тем не менее, продолжительность реакции требует эмпирического определения, в зависимости от цели анализа. В …
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим профессора Кристофа Englert и профессор Didier Stainier для подарив Т.Г. (wt1b: GFP) li1 и Tg (kdrl: EGFP) s843 штаммы, соответственно, и Тайвань рерио Основной фонд для обеспечения Tg (kdrl: mCherry) CI5. Это исследование было поддержано грантами Министерства Тайваня по науке и технике (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).
Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 |
DMSO | Sigma | D8418 |
Glycerol | USB | US16374 |
Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 |
Nicotinamide | Sigma | N0636 |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 |
4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C |
Nusieve GTG | Lonza | 50081 |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 |
Phenylthiourea | Sigma | P7629 |
Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab |
PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 |
Reef Salt | AZOO | AZ28001 |
trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 |
Triton X-100 | Sigma | T8787 |
Tween 20 | Sigma | P9416 |
Vibratome | Leica | VT1000M |