Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
Biofilme bestehen aus Gruppen von in einem selbst sezerniert Matrix eingeschlossen Bakterien. Sie spielen eine wichtige Rolle in der industriellen Verschmutzung sowie in der Entwicklung und Persistenz von vielen gesundheitsbezogenen Infektionen. Eines der am besten beschrieben und untersucht Biofilmen in der menschlichen Erkrankung tritt bei chronischen Lungeninfektion von Mukoviszidose-Patienten. Wenn Biofilme im Rahmen des Host studieren, können viele Faktoren die Biofilmbildung und Entwicklung beeinflussen. Um zu ermitteln, wie Wirtsfaktoren die Bildung von Biofilmen und Entwicklung beeinflussen können, haben wir eine statische chambered Abdeckglas Methode Biofilmen in Gegenwart von Wirt abgeleiteten Faktoren in Form von Sputum Stände zu wachsen. Die Bakterien werden in die Kammern ausgesät und Sputum Filtrate ausgesetzt. mit einem handelsüblichen Biofilm Lebensfähigkeit Kit vor der konfokalen Mikroskopie und Analyse folgenden 48 h des Wachstums werden Biofilme gefärbt. Nach der Bildaufnahme können Biofilm Eigenschaften mit Hilfe Plattformen unterschiedlicher Software bewertet werden.Dieses Verfahren ermöglicht es uns, Schlüsseleigenschaften von Biofilmwachstum in Gegenwart verschiedener Substanzen einschließlich Antibiotika zu visualisieren.
Introduction
Bakterielle Biofilme sind Gruppen von Mikroorganismen, die miteinander und umhüllt in einer selbst sezerniert Matrix gebunden sind. 1,2 Classically stellen sie Bakterien physisch an einen abiotischen oder biotischen Oberfläche unter den Bedingungen der Strömung gebildet angebracht. Biofilme sind auch gezeigt worden, unter statischen Bedingungen (keine Strömung) und distal von Oberflächen, beispielsweise an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche der thermischen Pools oder Häutchen gebildet in Reagenzgläsern zu wachsen. Diese Biofilme sind seit langem in der Umwelt erkannt und sind eine große Nachteil für industrielle Prozesse, wie sie in Wasserbehältern oder in Rohren bilden können, was zu Biofouling, Korrosion und Verstopfung. 3,4
Biofilme sind auch im Gesundheitsbereich kritisch, da sie in Katheter bedingten Infektionen, Lungeninfektionen bei Mukoviszidose-Patienten, sowie in zahlreichen anderen Infektionen beteiligt haben gezeigt werden. 5,6 Eines der Markenzeichen von Biofilm – Infektionen ist die deerhöhte Empfindlichkeit von Bakterien gegen Antibiotika und die Beeinträchtigung der Clearance durch das angeborene Immunsystem. 7-9 Die gut untersucht, klinisch relevante Szenarien Biofilm-basierten Infektion beteiligt tritt bei Patienten mit zystischer Fibrose (CF), die chronisch infiziert sind , mit Pseudomonas aeruginosa Biofilme. P. aeruginosa kann eine Reihe von Änderungen bei Etablierung einer chronischen Infektion zu unterziehen , die es sehr schwierig zu behandeln , machen. 10,11 Biofilme können unterschiedlich angeborenen Immunität aktivieren und Entzündung fahren. 12-14 Da diese Infektionen zu einer erhöhten Morbidität und Mortalität bei CF – Patienten führen, ist es wichtig , Faktoren zu verstehen , die Biofilmbildung in diesem Zusammenhang beeinflussen können.
Eine neue Studie schlägt vor , dass Host-Faktoren bei der Bildung von P. aeruginosa Biofilm Aggregate kritisch sind. 15 Diese Biofilme tragen zu einer reduzierten Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika und Abwehrmechanismen des Wirts. Die Presenz von Wirt-abgeleiteten Faktoren, wie Neutrophilen-Elastase, sowie sekretierte Produkte von Mikroorganismen, die in der CF-Lunge, haben das Potential stark zu Biofilmbildung und Entwicklung modulieren. 16 Darüber hinaus interagieren Biofilmen mit dem Host – Expression zahlreicher Wege zu modulieren und Entzündungen auslösen. Während Hochdurchsatzverfahren, wie zum Beispiel die Standardkristallviolett-Assay, einige Informationen in Bezug auf die Biofilmverfahren zur Verfügung stellen kann, die Visualisierung des Biofilms in Reaktion auf diese Faktoren liefern weitergehende Informationen.
In diesem Manuskript beschreiben wir ein Verfahren zur Faktoren aus dem Sputum von Patienten mit CF mit der Entwicklung von Biofilmen in vitro zu studieren. Dieses Verfahren ermöglicht eine schnelle Visualisierung von auf Sputum enthaltenden Wirtsfaktoren ausgesetzt Biofilmen Kommerzielle Biofilm Lebensfähigkeit Kit. Diese Technik kann verwendet werden, um visuell Veränderungen zu identifizieren, die während der Biofilmwachstum in Gegenwart von exogeno auftretenuns Produkte und stellt ein verbessertes Verfahren der Änderungen in Biofilmentwicklung unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen die Visualisierung von bakteriellen Biofilmen in Gegenwart von exogenen Produkten gewachsen. Es überrascht nicht, die Herstellung der exoproducts ist von Bedeutung, wenn diese Art von System. Zum Beispiel Dithiothreitol (DTT), wird häufig auf die menschliche Sputum-Proben verwendet, um die Proben helfen verflüssigen. Jedoch allein der Wirkung von DTT Biofilmentwicklung verringern kann und die Lebensfähigkeit (Daten nicht gezeigt). Somit sind geeignete Kontrollen für a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TB erkennt ein Forschungsstipendium von Cystic Fibrosis Kanada.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
