Herstellung von rAAV9 überexprimiert oder Sturz Gene in Mäuseherzen

Steuern Expression oder Aktivität von spezifischen Genen in verschiedenen biologischen Systemen ist eine wertvolle Strategie bei der Untersuchung der Genfunktion ¹ geworden. Eine direkte Mittel, um dieses Ziel zu erreichen, ist zu Nukleotid-Sequenzen manipulieren und Mutantenallelen erzeugen. Obwohl machen präzise, ​​gezielte Veränderungen des Genoms von lebenden Zellen ist noch eine zeitaufwendige und arbeitsintensive Praxis, die Entwicklung der mächtigen TALEN und CRISPR / Cas9 Tools hat eine neue Ära der Genom Bearbeitung ^2-5 geöffnet. Eine Routinelaborverfahren zur Genmanipulation hat sich auf die Einführung von genetischem Material (DNA und RNA – kodierenden Sequenzen oder siRNAs / shRNAs enthält) fokussiert in die Zellen , die das Gen (e) von Interesse ^1,6 zum Ausdruck bringen oder Knockdown.

In vielen Fällen ist der Haupt Engpass für Genmanipulation die Abgabe von DNA, RNA oder Protein in die Zellen. Im Hinblick auf die in vitro – Studien, effiziente transfectiauf Systeme wurden in vielen kultivierten Zellinien etabliert. Im Mausmodell ist jedoch, insbesondere in vivo Genübertragung anspruchsvoller. Es gibt eine Reihe extra- und intrazelluläre Barrieren, um umgangen werden müssen effiziente zelluläre Aufnahme der exogenen Reagenzien zu erreichen. Weitere Hindernisse sind die schnelle Clearance und die kurze Dauer der ^7,8 gelieferten Materialien. Eine Strategie , um diese Probleme zu umgehen , ist die virale Vektoren als "Träger" zu verwenden oder "Vehikel" für in vivo – Genübertragung. Die natürlich entwickelte Transduktionseigenschaften von Viren ermöglichen die effiziente Bereitstellung eines Gens von Interesse in Zellen ^7,9,10. Zahlreiche Arten von viralen Vektoren wurden in vivo Genmanipulation in verschiedenen Zelltypen und Organe in Mäusen entwickelt und flexible ermöglichen.

Die am häufigsten verwendeten viralen Systeme umfassen Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus und Adeno-assoziiertes Virus (AAV) <sbis> 11. Retroviren sind RNA – Viren einzelsträngig und kann in stabiler Weise während der mitotischen Teilung, sofern das Potential für lebenslangen Expression der transduzierten Gene in die Zielzellen und Organen ^12-14 ihres genetischen Materials in die Wirtszellgenom einzuführen. Viele Arten von Retroviren jedoch infizieren nur sich teilende Zellen, und ihre Wirksamkeit in sich nicht teilende Zellen ist sehr gering ^15. Dies schränkt ihre Nützlichkeit für den Gentransfer. Lentivirus ist eine Gattung der Retroviridae Familie. Unterscheidet sich von anderen Retroviren, Lentivirus kann infizieren sowohl Dividieren und nicht teilende Zellen und wurde für den Gentransfer in post-mitotische und hochdifferenzierten Zellen ¹⁶ verwendet. Der Lebenszyklus von Lentivirus beinhaltet auch die Integration von Vektor-DNA in das Wirtsgenom. Somit ermöglicht Lentivirus-vermittelte Genabgabe stabile und langzeitige Expression der transduzierten genetischen Elemente ^16-18. Jedoch kann dieses Merkmal eine Doppel e darstellendged Schwert in der Verwendung dieser Viren die Genexpression zu manipulieren, da die Integration von Vektor-DNA zur Insertionsmutagenese führen in den Wirtszellen und können artifizielle Wirkungen verursachen. Adenovirus ist ein weiteres weit verbreitetes Genabgabesystem. Im Gegensatz zu Retroviren und Lentiviren, Adenoviren sind nicht integriert und nicht mit der genomischen Integrität von Wirtszellen ^8,10,11,19 stören. Zusätzlich können Adenoviren DNA in viele Zelltypen zu transfizieren, und die Infektion ist nicht abhängig von aktiven Zellteilung ^19. Ein weiteres wichtiges Merkmal von Adenoviren ist die Leichtigkeit der Vektor Reinigung, da die viralen Vektoren haben die Fähigkeit , ^19,20 repliziert werden. Allerdings ist der Haupt Einschränkung dieses Systems , dass Adenovirus – Infektion ¹⁹ starke Immunantworten in Zielzellen und Organen auslösen können, deren Verwendung in vielen Untersuchungen beschränken, insbesondere in Gentherapiestudien.

Im Vergleich zu diesen anderen Typs von viralen Vektoren, rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) scheint die ideale Genabgabesystem ^21,22 sein. Es zeigt minimale Immunogenität und Pathogenität ^23,24. Darüber hinaus infiziert rAAV ein breites Spektrum von Zelltypen, einschließlich sowohl Unterteilungs- und nicht teilende Zellen. In den meisten Fällen ist nicht rAAV in Wirtsgenome integriert; Somit ist die Gefahr einer unerwünschten genetischen oder genomischen Veränderungen in den Zielzellen gering ^22.

In jüngster Zeit wurden rAAV – Systeme wurden für die in vivo Abgabe von DNA , die für Proteine, miRNAs, shRNAs und CRISPR-gRNAs in Maus Herzmuskel ^23,25-29 erfolgreich eingesetzt. Diese Methodik hat erleichtert grundlegenden Untersuchungen und Gentherapie-Studien auf dem Gebiet der Herz-Kreislauf-Forschung. Hier wird die detaillierte Prozedur rAAV9 Vektoren zu erzeugen, die effizient überexprimiert oder die Gene von Interesse in Mäuseherzen Knockdown beschrieben wurde. Das Protokoll bietet eine einfache und effektive Methode,kardialen Genexpression in murine experimentelle Modelle manipulieren.