对细胞的超快磁化阳离子化Magnetoferritin的合成

人类骨髓间充质干细胞（hMSC）作为从接受全髋关节置换手术，完全按照布里斯托尔Southmead旅馆医院研究伦理委员会的指导方针（参考＃078/01），得到病人的同意后，骨关节炎患者股骨近端骨髓收获。 1. Magnetoferritin合成和纯化 总论 在65℃氮气氛下在一个密封的，双夹套反应容器中执行magnetoferritin合成以限制金属前体的氧化。通过接入端口在盖成使用注射泵将反应容器注入金属盐溶液和过氧化氢。 magnetoferritin合成后，通过净化阴离子交换色谱蛋白质（参见1.4节）删除没有用蛋白质纳米腔，其次是尺寸排阻色谱法（见1.5）分离蛋白单体。德使用Bradford测定termine蛋白浓度（参见1.6节）。 准备工作之前，合成 通过将连接到在水中氮气气缸的管，密封与保鲜膜容器，并通过氮气进行大约60分钟鼓泡脱氧500毫升去离子水。 热连接到双夹套反应容器到65℃的水浴中。加75毫升50毫4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（pH 8.6）到反应容器中，通过经由缓冲溶液约20分钟，使氮气鼓泡密封容器中，和去氧。在同一时间，搅拌使用磁力搅拌器的缓冲溶液。 脱氧的HEPES缓冲溶液后，取出管从缓冲器供给氮气，并保持它悬浮在保持氮气气氛的容器中。添加脱辅基铁蛋白来实现的3毫克/米的最终浓度湖继续磁力搅拌，但如果发生发泡降低搅拌速度。 通过在50毫升脱氧去离子水0.19克溶解制备硫酸钴七水合物的25mM储液。 通过在100毫升脱氧去离子水0.98克溶解制备的铁硫酸铵六水合溶液的25mM溶液。 中除去2.5毫升铁硫酸铵六水合溶液和2.5毫升硫酸钴七水合物的替换。 通过首先将965微升过氧化氢溶液（30％W / W）到9毫升脱氧去离子水，然后加入1ml这个分库存来99毫升制备的脱氧去离子水中的过氧化氢的8.33毫溶液脱氧去离子水。 Magnetoferritin合成 注入10.1毫升两个铁 – 钴前体与过氧化氢的同时进入脱辅基铁蛋白溶液（磁小号tirred）在以0.15毫升使用两个注射泵/分钟的流速（总体积注射20.2毫升）中。 在注射期间，脱氧另外500毫升去离子水。 注意：反应容器的内容物逐渐采用暗褐色随着反应的进行。 不久第一次注射完成之前，准备另一个百毫升铁 – 钴前体，并使用新鲜的脱氧去离子水的过氧化氢溶液。 重复使用铁 – 钴和过氧化氢的新制备的溶液在1.3.1中描述的注射步骤。 在注射期间，脱氧另外500毫升去离子水，并在1.3.3和1.3.4所述进行操作。 在第三次注射后，离开溶液成熟搅拌下15分钟。 加为1.5ml的1M柠檬酸钠溶液到反应容器中以螯合游离在溶液中的金属离子。 除去从反应后的溶液容器到50ml离心管，离心在4,350 xg离心30分钟，并通过0.22μm注射过滤器传递上清液。在这一阶段，经过滤的上清液可以储存于4℃直至纯化。 离子交换色谱法 加载样品在含有用蠕动泵以10毫升/分钟的流速的阳离子基质的柱（直径为2.5厘米，长20厘米）。 与有约100ml用梯度泵以10毫升/分钟的流速运行缓冲液（50mM三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）缓冲液，pH 8.0）洗涤柱。 为了洗脱蛋白质，以10ml /分钟洗涤柱子用氯化钠（NaCl）的Tris缓冲液浓度的增加：150，500和1000毫最终NaCl浓度，加入150ml各浓度。 作为蛋白质洗脱在500毫的NaCl浓度，使用自动级分收集器收集它在50毫升馏分。 注：对于离子交换层析的详细的协议协商先前公布的协议。 26 尺寸排阻色谱法 浓缩150毫升magnetoferritin来的使用一个15毫升的离心过滤器单元随后4ml的体积单元约2毫升体积。参考离心过滤单元的制造商的说明（参见材料清单）此过程的详细协议。 加载浓缩样品到使用注射循环凝胶过滤柱。 用运行缓冲液（50mM Tris缓冲液，pH值8.0，含有150mM NaCl）中以1.3毫升/分钟的流速洗柱。 收集用自动级分集流管6毫升级分。蛋白质单体洗脱过去的。在这一点上，纯化magnetoferritin可以储存在4℃直至阳离子。 注：对于使用凝胶过滤柱的尺寸排阻色谱法的详细协议协商previously出版协议。 27 确定蛋白浓度 制备使用市售马脾铁蛋白的0.06，0.125，0.25,0.5和1mg / ml，在50mM Tris缓冲液铁蛋白的标准。 注：可商购的铁蛋白的蛋白质浓度在瓶子中指出。如果没有，与供应商联系以获得该信息。 稀释未知浓度的magnetoferritin样品在50mM Tris缓冲，直到溶液的颜色为0.5mg / ml标准的颜色大致相匹配。记下稀释倍数。 添加10微升一式三份每个标准和magnetoferritin试样到96孔平板的孔中。 加入200μl现成Bradford试剂以每个孔（参考材料清单用于Bradford测定试剂详细信息）。 在室温下孵育8分钟。 使用测量在λ= 595nm处的吸光度酶标仪。 积的铁蛋白的标准平均吸光度作为蛋白质浓度的函数，并使用线性拟合的斜率和截距来计算magnetoferritin样品的浓度。 注意：考虑到这是用来调整magnetoferritin样品，通过标准曲线稀释因子。 2. Magnetoferritin阳离子化 总论 注：对于magnetoferritin阳离子，N，N-二甲基-1,3-丙二胺（DMPA）偶联到使用N-对MF表面上天冬氨酸和谷氨酸残基- （3-二甲氨基丙基） – N'-ethylcarbodiimide盐酸盐（EDC）。 进行在室温下在搅拌下进行反应。下面给出的协议为10毫克magnetoferritin的在5毫升 （蛋白质浓度2毫克/毫升） 的总体积的阳离子化。然而，放大或缩小通过保持蛋白质：DMPA：EDC比率相一致，以及缓冲和magnetoferritin溶液的体积。 之前的阳离子化反应中，透析的magnetoferritin样品到含有50mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液（pH 7）。这是很重要的，除去的Tris洗脱缓冲液，避免的Tris胺和EDC·活化的羧酸残基之间的不希望的反应。确定蛋白质浓度透析后，把它调整到阳离子/ ml的前4毫克。 阳离子协议 称出374毫克的DMPA和2.5毫升的200mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲液溶解。 调整用浓（6M）盐酸（HCl）溶液的pH值至约7。 注意：执行在通风橱中此步骤中，作为添加酸的DMPA释放有毒气体！ 添加2.5的magnetoferritin溶液混合物在4毫克/毫升（最终concenMES的tration为100mM，magnetoferritin的最终浓度为2毫克/毫升，蛋白质的总量为10毫克）。 加磁力搅拌器和搅拌2小时达到平衡。 仔细调整使用1M的HCl溶液至pH 5.0。 141毫克EDC粉添加到DMPA / magnetoferritin解决方案。 继续搅拌3.5小时。 过滤通过0.22微米的注射器过滤溶液以除去任何沉淀物。 添加该溶液至透析管与12-14 kDa的分子量截止和透析针对4升含有50mM NaCl的2天，4℃50mM磷酸盐缓冲液（pH 7），取代的透析缓冲液的至少三个在此期间倍。 注意：在这一点上，阳离子magnetoferritin可以储存在4℃直至进一步使用。 3.人力间充质干细胞标记与阳离子化Magnetoferritin 总论 <lI>在37℃和5％二氧化碳的气氛下进行使用II类层流柜和加湿培养箱所有细胞培养物。 培养细胞作为使用单层175厘米2烧瓶和20毫升培养基，将其每3补充的- 4天。培养基由Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM），含有1000毫克/升葡萄糖，10％（体积/体积）胎牛血清，1％（体积/体积）青霉素/链霉素溶液，1％（V / V）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液和5纳克/毫升新鲜补充人类成纤维细胞生长因子。 的hMSC磁标记与阳离子化magnetoferritin 种子150000的hMSCs成为25cm 2烧瓶中并离开粘附过夜，在37℃。 过滤通过0.22微米的注射器过滤器消毒的阳离子化magnetoferritin并确定蛋白质浓度。 保持无菌的条件下，准备阳离子化magnetoferri的0.5微米的解决方案在磷酸锡缓冲盐水（PBS）。保持封在无菌培养罩直到使用。 洗铺板的细胞用2ml室温PBS中。 1毫升灭菌阳离子magnetoferritin溶液添加到接种的细胞孵育所需的时间段（1分钟至1小时）。 通过加入0.5ml的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），并在37℃孵育5分钟，用PBS洗细胞，然后收获细胞。 加入1ml培养基的灭活胰蛋白酶/ EDTA，在524×g下将溶液转移至15毫升离心管中并离心5分钟。 弃去上清液并重新悬浮于0.5ml的细胞沉淀磁选缓冲液，由0.5％（重量/体积）胎牛血清和2mM EDTA的PBS中。 磁性细胞分离 磁体连接到所述多台，和一个磁选列添加到磁体。放在日的预剥离过滤器Ë列。 放置0.5毫升磁选缓冲液中预分离滤波器，让它通过滤波器和清洗和湿它们列都运行。 放置一个15毫升的离心管列之下。 加入0.5毫升细胞悬浮液中的磁性分离柱的过滤器储存器。 当水库是空的，将0.5ml磁分离缓冲。 当水库是空的，进一步增加0.5毫升磁选缓冲。 重复一次（用于洗涤应1.5毫升磁选缓冲器的总体积）。此洗涤步骤洗脱所有非磁化细胞从塔（未磁化细胞级分）。 从磁体取出柱，并将其放置在一个新的15ml离心管中。从塔储除去的过滤器。 1毫升磁选缓冲器添加到储存器和通过该柱使用由制造所提供的柱塞立即推河此洗脱从柱到离心管（磁化细胞级分）的磁化的细胞。 离心两管在524×g下5分钟。 弃去上清液并重新悬浮在0.3ml毫升的PBS细胞沉淀。 计数细胞数在每个级分使用血球数。 确定磁化细胞级分中，M（％），使用以下等式： 其中，n（M）是细胞中的磁化馏分和n的数量（M + NM）是细胞中的磁化和未磁化的级分的数目的总和。 制备使用电感耦合等离子体发射光谱标记为铁量化阳离子化magnetoferritin的hMSCs（ICP-OES） 注：该协议可能需要适于其他ICP-OES仪器。这是明智的重新咨询sponsible技术员。 离心的已知数量的细胞在524×g下5分钟。 除去PBS上清，加入为0.25毫升50％（体积/体积）硝酸。 涡混合酸化细胞悬液。 在室温下孵育过夜。 加4.75毫升蒸馏水向每个样品并涡旋混合。 用ICP-OES分析。 28 归一化测定铁含量对细胞的数目，以确定蜂窝铁含量的值。