在动物标本呼吸道病原体的高通量检测通过纳米PCR

没有人体或实验动物用于本协议的发展。通过序列证实扩增子的纯化及在 RNA靶体外转录生成控件。临床样品提交常规诊断测试康奈尔动物健康诊断中心。 1.保护板设计使用引物设计软件，以验证每个检测符合用60℃退火用引物探针测试工具标准的基于探针实时PCR循环条件（选择量化探头使用默认参数设置）。 注：所使用的RNA代表目标是改编自通用流感舒等人发表的矩阵分析目标7。是引物和探针如下：正向引物：GACCRATCCTGTCACCTCTGAC，反向引物：AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA，探针：FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY。这里使用的代表性的DNA测定来回适于米乘埃利亚等发表的马疱疹病毒1型（EHV-1） 的检测方法。8。是引物和探针如下：正向引物：GCTCTCAGGTTTTACGACATC，反向引物：CTTTACCCAGGCCCTTGAAA，探针：FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY。 要想在需要的配置纳米级PCR扩增板。 注意：对于该研究，使用了18×3基因表达格式（ 表1）。为每个目标制造商的所有引物和探针（或盘点法ID）的序列。 2.核酸提取用任何所需的方法提取总核酸（DNA和RNA）。 注意：一个自动化基于磁珠的提取试剂盒根据制造商的说明在这里使用的（更多细节的材料表）。 制备的样品如下： 清洁每个样品容器用10％漂白粉彻底干燥外。擦拭手套˚F英格技巧与样品防止交叉污染的10％漂白粉。 地方鼻或用生理盐水几滴在任何无菌，密封小瓶深咽拭子（如红色顶部血液收集管中）加入，以防止在处理之前干燥。 注：棉花，塑料，木材，处理，涤纶等合成拭子都是可以接受的，但要避免藻酸钙拭子。 为拭子和气管洗涤，添加的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），使得存在至少1-2的液体毫升。 VORTEX棉签和DMEM大力在管。然后，使用吸液管到约1ml的媒体转移到新管中。 机械裂解组织（100-200毫克的1ml DMEM中）使用根据制造商的说明，随后通过离心在825×g下3分钟的组织破坏剂。转移500μl的上清液至新管。 对于粪便，结合400毫克粪便与800微升1X磷酸盐缓冲的sa在线pH 7.4（PBS）中。涡旋混合1分钟或更长时间的悬浮液，直到所述样品是均质或完全中止。一旦均质，离心10分钟将悬浮液于18,000 xg离心，然后加入400μl转移到一个新试管中。 对于全血未凝结，涡旋样品，并进行250微升等分。添加溶解剂和旋涡六滴混合。孵育在37℃下15分钟。 根据制造商的说明制备的裂解和洗涤缓冲液。添加MS2噬菌体或选择的裂解缓冲液的内部对照作为内部阳性提取控制9。 添加裂解缓冲液的235微升和175微升样品（或PBS作为阴性对照）与每个胎圈管。制造商的协议进行。 注：纯化总核酸在这里洗脱90微升。 3.逆转录/预放大（前置放大器） 注意：保持中使用的所有试剂和样品在任何时候都冰上前置反应。继前置放大器，把所有试剂室温。 组装洗脱的DNA和/或RNA，PCR反应混合物，无核酸酶水作为阴性对照，并且对于阳性放大控制汇集标准。 注：最多48个样品可以在放大板包括控制运行（包括每个撤出板从样品被拉至少一个负提取控制）。 打印出样图。有第二人检查，地图和样品布局相匹配。 在1.5 ml管中，添加以下准备前置主结构。 注意：这里使用的14微升最终体积。 加的从每个目标预混引物库，使得每个引物的终浓度为900纳米。 注：此处使用的池在10倍浓度制备，并且每个反应加入1.4微升。 随机引物添加到600纳米或0.1×的最终浓度。 </l我> 2×RT-qPCR的组合加入到最终体积的一半（这里7微升）。 轻轻涡旋和停转混合母液组件连接在一起。 使用该板只（列1-6）的左侧在标准的96孔平板进行前置放大。 添加前置主混合物的8.5微升和DNA / RNA样品的5.5μl到每个孔中。 结合所有试剂（样品，阳性对照，用前置放大器组合阴性对照）之后，彻底密封用透明的粘合剂密封的标准的96孔板中。用刀片，以防止循环过程形成密封间隙消除任何多余的密封。离心密封板用于使用PCR板喷丝20秒。检查，以确保所有的试剂都在板孔的底部相结合。 在下列条件下运行的常规热循环前置放大器测定：在50℃下15分钟在95℃下1分钟;在95℃，然后用2分钟，在60℃下15秒的20个循环; 99.9＆＃176℃持续10分钟;保持在4℃。项目启动前，这些条件。 打开传统的热循环仪，选择前置循环程序和启动程序。放置96孔板中的热循环，只有当热循环仪（未盖）的底部到达通过监测温度读数在屏幕上用于cDNA生产（50℃）所需的温度。在此之前，保持板冷以减少产生假阳性结果的风险。 一旦前置放大器运行完成，验证板一直保持密封。 立即进行步骤4.1。过夜存储该板，如在步骤4.2至4.5中所述，除了代替松散覆盖板进行稀释，密封用透明的粘合剂密封，并代替拉链锁内袋，保存在4℃下的板。 4.稀释前置放大器板除去扩增板的适当数量的往复m为冷冻（最多4可以一次运行）。不要打开包装。允许板预热在室温下至少15分钟。记录盘的序列号和批号。 注：未开封板可在室温下保持长达24小时，但对于最佳操作，从不超过30分钟，需要之前冷冻除去这些。 离心完成前置放大器板使用PCR板微调20秒。打开放大机及电脑上，并启动相应的程序。 删除从PCR设置区域中的所有不必要的物品。戴上双层手套和套管盖。 从前置放大器板取下密封，小心地取出并丢弃外手套。通过上下吹打加入56微升TE缓冲液中，以列96-前置放大器板1-6和混合的各孔5：稀释前置产品1。只去吸管的第一站，从底部吸液和分配上涨，但没有创造气泡。加入TE缓冲所有6列，无论使用的水井。 重新密封带任何明确的粘合剂或铝箔密封板，离心它采用PCR板微调20秒。抛开这个板块（松散覆盖），直到6.1步完成。丢弃剩余的手套，套盖。 5.准备384孔板转移到放大板建立覆盖和密封板放大所需材料：盖子，塞，浸渍液，板压，乙醇喷瓶，不起毛的实验室湿巾注射器。取下注射器盖并锁定一个小塑料尖到注射器（需要力）。喷射浸没流体的少量到纸巾以除去空气积聚（这是确定是否一些小气泡残留在尖端）。除去从真空密封的铝袋在注射器在60分钟内使用浸没流体。一旦注射器被打开，不重新安装供以后使用的瓶盖。 检查该印版装载液体处理器的废物箱是空的，打开的提示框。写在当一个新盒子被打开的提示框盖提示的到期日期，并确保该提示是没有过期。打开液体处理器和计算机并打开液体处理器软件，这将执行自检。 点击“设置和装载”。点击“浏览”选择从样品追踪软件创建的CSV文件。如果没有显示文件，进入“仪器/编辑首选项”，然后单击“更改”的“样品盘文件夹”。选择其中的CSV文件保存的文件夹。然后，单击“设置和加载”，然后选择“浏览”，选择该文件。 接下来，单击“浏览”旁边的“板夹位置1”，并选择具有相同的序列号板的TPF文件（由制造商提供）。 6.液体处理器转移注意：不要启动网络灌装在384孔板，直到所有的上述步骤完成。蒸发量小卷的关注 – 不要让384孔板坐在里面发现了液体。 一旦所有的上述步骤完成后换上新的，很好地符合双手套，套盖。然后，添加2.5微升的扩增主混合物至384孔板中。 根据地图转移2.5微升稀释前置产物到384孔板在表2中，并立即用箔密封紧紧盖住板。丢弃外手套，套盖。 离心机在PCR板喷丝20秒的384孔板中。 不要取下铝箔封口，但放置在384孔板的液体处理器。 打开包装含包裹放大板并小心地将它与右边的序列号的第一个插槽的液体处理器 – 持有的边缘的情况下不接触面ÔF中的板。开口的一小时内使用展开板材。 注意：这样的目的，是为了保护板从被触摸，因为这可能会扰乱通孔内的少量的引物和探针。 从液体处理器内的384孔板取下铝箔封口一旦一切就绪。点击下一步，然后选中所有的复选框，因为每个步骤完成。点击OK开始运行。 关闭的大门液体处理器，并立即开始灌装过程。留旁边的液体处理器和立即进行下一步骤，一旦板被充满。 而液体处理程序正在运行时，从壳体盖的底部除去的保护膜。 注意：在壳体盖的底部的粘接剂是由一个红胶带和保护膜覆盖。这部电影需要先访问繁文缛节被删除。 留在原地顶部薄膜直到步骤6.15。总理繁文缛节通过稍微拉到releas从胶电子吧。 从液体处理器取出装入（饱满）扩增板和轻轻地用在右边的序列号将其放置在板压机。 将盖子上与在底部（朝向板指向）右侧和粘合剂的切口端板的顶部。 拉下板压杠杆小心关闭它;灯将闪烁20秒。在此期间，请勿触摸平板机。一旦指示灯变为稳定的绿色，仔细地抬起杠杆，并小心地抱着它的边缘取下密封板。 而垂直地保持密封放大板由壳体的边缘，立即插入注射器尖端到在壳体的端部的装载端口，则分配所述浸没流体慢慢在一个轻柔的连续运动以填充板和之间的空间盖。留一个小气泡在角落里，一旦板浸入。 同时继续为h老板垂直的边缘，通过插头插入端口，顺时针旋转插头扭动，施加足够的压力，直到手柄脱落密封装货港。把手的情况下的边缘牢固地使手柄断裂的力不会导致的情况下下降。如果板丢弃，丢弃它。 用抹的无绒布已用乙醇彻底清洁喷的情况。干燥的情况下，向下擦拭外壳用干净​​的擦拭。轻轻地处理;一定不能在井上面的玻璃施加压力。 使密封板的放大机。在“仪器”选项卡，选择“仪表控制台”。选择放大机，然后点击“开门”按钮。 放置在板适配器的第一槽的放大板，检查在左上角的适配器正确排队与A 1。定向与条形码的板朝上和朝仪器的前部。点击“关闭门”按钮。注意使用适配器托盘 – 有10个用途的限制。 在屏幕底部的选项卡，Run菜单下，选择OpenArray。点击“获取板的ID。”空盒将与有关铭牌信息自动填充。要开始运行，请单击“开始→运行”。 关闭液体处理器软件和关闭液体处理器。将在尖机架顶端盖。丢弃从垃圾箱的提示和清洁。清洁和消毒的所有项目，包括在工作面上，吸管，垃圾斗，和提示框。 重新封装用透明胶密封并储存在-20°C的前置放大器板。 7.结果分析一旦运行完成，保存文件，然后点击与运行名称选项卡上的“X”在屏幕的底部，关闭文件。 点击“打开门“在屏幕上打开门的顶部，拆下放大板，检查没有浸液泄露出去了。点击”关闭门“，在屏幕的顶部关门。 点击“打开”，并选择运行文件，将其打开。按绿色屏幕右上方分析按钮。点击屏幕的左侧，然后在“开始导出”“导出”导出结果（如.txt文件）。它打开后最小化文件。然后，单击“导出QC形象。” 根据以下标准的图像分析程序审查QC图片： 使用预READ_CHANNEL_4.tiff和POST-READ_CHANNEL_4.tiff，通过检查，有没有暗斑或污迹评估装载质量。 注：此信道检测到的染料是由制造商到引物和探针，该反应被加载时被释放到溶液中。在这个通道中的读数表明，反应是正确的加载并与染料混合引物和探针出席了会议。 检查使用S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp＃_spotfind.tiff加载后的泄漏或搅拌到板上。如果图像看起来黑暗，增加亮度（按Ctrl + Shift + C打开控制），直到整个板块是可见的。检查图像看起来均匀，无阴影，气泡，或流离失所样本。 评估使用STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff和STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff下盖（亮点）盖放置和碎片。 可选：打开包含宏的结果（补充代码文件）的电子表格。在导出数据文件，右键单击该选项卡上的在屏幕的底部，并选择“移动或复制”。在“预定”栏，选择“结果Macro.xlsm”。点击“移动结束”，并勾选“创建副本”。然后，点击确定。 如果结果微距选项不会出现在“预订”领域，SIM卡层复制导出的数据文件工作表的内容（点击左上角的单元格以突出显示所有细胞和Ctrl-C）并粘贴到一个新的标签。 删除旧的“导出”选项卡，然后重命名新添加的选项卡中的“导出”。 点击“ALT-F8”（或单击视图，然后宏），然后选择“宏”，然后单击“运行”。然后点击“ALT-F8”然后选择“Macro2”，然后点击“运行”重复此为Macro2。 重命名使用的相关信息（日期和序列号）的结果宏文件，把表以上这些信息，并保存为导出的结果文件夹相同的文件名。最后，打印出宏观生成的结果表。 在放大机软件，由在屏幕的左侧选择分析/扩增曲线检查每个样品和控制针对宏表的曲线。然后，选择样品标签，然后点击每个样品确认有2或3的每个表中的阳性结果的阳性扩增曲线。 关闭放大机。