Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
клеточная цитотоксичность NK является широко используемым показателем для определения влияния внешнего вмешательства на функцию NK-клеток. Тем не менее, точность и воспроизводимость результатов этого анализа можно считать нестабильным, либо из-за ошибок пользователя или из-за чувствительности клеток NK к экспериментальному манипулированию. Для устранения этих проблем был создан рабочий процесс, который сводит их к минимуму и представлена здесь. Чтобы проиллюстрировать это, мы получили образцы крови, в различные моменты времени, из бегунов (n = 4), которые были представлены в интенсивный бой упражнений. Во-первых, NK-клетки одновременно идентифицируют и выделяют через CD56 мечения и магнитной сортировки на основе, непосредственно из цельной крови и от всего лишь один миллилитр. Отсортированные клетки NK удалены из любых реагентов или укупорки антител. Они могут быть подсчитаны с целью установления точного подсчета клеток NK на миллилитр крови. Во-вторых, отсортированной клетки NK (эффекторы клетки или E) могут быть смешаны с 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine Хлорнокислый (DIO) помечено клетки К562 (клетки-мишени или Т) на тест-оптимальным 1: 5 T: отношение E, и анализировали с использованием изображений проточные цитометр, который позволяет для визуализации каждого события и устранение любых ложных срабатываний или ложных негативов (такие как дублеты или эффекторных клеток). Этот рабочий процесс может быть завершен в течение примерно 4 ч, и позволяет очень стабильные результаты даже при работе с человеческими образцами. При наличии, исследовательские группы могут испытать несколько экспериментальных вмешательств у больных людей, и сравнить измерения в нескольких точках времени без ущерба для целостности данных.
Introduction
Естественные клетки-киллеры являются существенным элементом врожденной иммунной системы. В то время как они очень регулируются, они обладают способностью распознавать и элиминировать аномальных клеток через клетки к клетке контакта и без предварительной активации 1. Таким образом, они образуют быструю линию защиты против инфекций. Физические упражнения, особенно интенсивно, как было показано, скоротечно угнетают иммунную систему 2, 3, 4, 5. NK – клетки, особенно подвержены этому эффекту 4, 6, 7, эффективно создание окна повышенной чувствительности к болезни. Таким образом, изучение мер до, во время или после интенсивной физической нагрузки с целью снижения его влияния на функцию NK-клеток представляет особый интерес для благосостояния спортсменов пост-соревнований.
<p class= "jove_content"> Тем не менее, изучение таких вмешательств осложняется многими факторами: 1) NK – клетки разреженным 8, при температуре около 1% числа белых клеток крови отсека; 2) NK-клетки очень чувствительны к стрессу и полагаться на постоянного воздействия на физиологические условия, чтобы оставаться жизнеспособными и стабильными во время экспериментов; и 3) стандартные анализы для определения цитотоксичности клеток NK, такие как Ficoll градиенты 9 и выпуск 10 анализов, являются ненадежными и непоследовательными. Присущая изменчивость человеческих образцов только усугубляют эти проблемы. Свежие образцы человека, собранные в ходе вмешательств достаточно регламентирована и сложно получить, по крайней мере, по сравнению с образцами, животных или иммортализованные клеточные линии. Это уменьшает возможность повторить эксперименты или добавить участников исследования когорты достичь значительных статистических пороговых значений. В совокупности эти вопросы подтверждают необходимость обтекаемый протокол, позволяющий FOг и с высокой пропускной способностью и анализ высоконадежный НК клеток литической активности в человеческих образцах.Мы создали рабочий процесс, который сокращает время, необходимое для идентификации, выделения и испытания NK-клетки из цельной крови человека при сведении к минимуму воздействия внешних факторов. Метод оптимизирует использование двух инструментов, магнитной основе сортировщика клеток и потока изображений цитометр, и анализ конкретных, оптимизированные T: отношение E, чтобы позволить обнаружение уменьшается или увеличивается клеточной цитотоксичности NK.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный в данном исследовании метод непосредственно измеряет удельную активность NK-клеток индивидуума в ответ на раздражители (в данном конкретном случае, продолжительные упражнения). Как правило, клетки NK изолированы от своей крови с использованием градиентов плотности или сорти?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , (2001).
