تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
NK الخلية السمسة هو مقياس يستخدم على نطاق واسع لتحديد تأثير التدخل الخارجي على وظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية. ومع ذلك، فإن دقة واستنساخ هذا الاختبار يمكن اعتبار غير مستقر، سواء بسبب أخطاء المستخدم أو بسبب حساسية الخلايا القاتلة الطبيعية للتلاعب التجريبية. للقضاء على هذه القضايا، تم إنشاء سير العمل الذي يقلل منها إلى أدنى حد ويرد هنا. ولتوضيح ذلك، حصلنا على عينات من الدم، في نقاط زمنية مختلفة، من العدائين (ن = 4) التي قدمت لنوبة شديدة من ممارسة الرياضة. أولا، الخلايا القاتلة الطبيعية ويتم تحديد وقت واحد وعزل من خلال وضع علامات CD56 والفرز على أساس المغناطيسي، مباشرة من الدم الكامل ومن اقل من واحد ملليلتر. تتم إزالة الخلايا القاتلة الطبيعية فرزها في أي كاشف أو متوجا الأجسام المضادة. ويمكن عدها من أجل إقامة دقيق NK عدد خلايا في كل ملليلتر من الدم. ثانيا، الخلايا القاتلة الطبيعية فرزها (المستجيبات الخلايا أو E) يمكن أن تكون مختلطة مع 3،3'-Diotadecyloxacarbocyanine البركلورات (ديو) الموسومة خلايا K562 (الخلايا المستهدفة أو تي) في ل1-فحص الأمثل: 5 T: نسبة E، وتحليلها باستخدام التصوير تدفق الكريات التي تسمح لتصور كل حدث والقضاء على أي إيجابية كاذبة أو السلبيات كاذبة (مثل الحلل أو خلايا المستجيب). ويمكن الانتهاء من هذا العمل في حوالي 4 ساعات، ويسمح للحصول على نتائج مستقرة جدا حتى عند التعامل مع العينات البشرية. عندما تكون متاحة، يمكن للفرق البحثية اختبار عدة تدخلات التجريبية في المواد البشرية، ومقارنة القياسات عبر عدة نقاط وقت دون التأثير على سلامة البيانات و.
Introduction
الخلايا القاتلة الطبيعية تشكل عنصرا أساسيا من نظام المناعة الفطري. في حين أنها تنظم جدا، لديهم القدرة على التعرف والقضاء على الخلايا الشاذة من خلال الاتصال خلية الى خلية ودون تفعيل مسبق 1. على هذا النحو، فإنها تشكل خط سريع من الدفاع ضد الالتهابات. ممارسة، وخاصة مكثفة، وقد تبين لخفض عابر جهاز المناعة 2، 3، 4، 5. الخلايا القاتلة الطبيعية معرضة بشكل خاص لهذا الغرض 4، 6، 7، على نحو فعال خلق نافذة تعزيز حساسية للمرض. ومن هنا فإن دراسة التدخلات قبل أو أثناء أو بعد ممارسة التمرينات الرياضية بهدف الحد من تأثيرها على وظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية هي ذات أهمية خاصة لرفاه الرياضيين بعد المسابقات.
<p class= "jove_content"> ومع ذلك، معقد دراسة مثل هذه التدخلات من قبل العديد من العوامل: 1) الخلايا القاتلة الطبيعية هي متفرق 8، في حوالي 1٪ من مقصورة خلايا الدم البيضاء. 2) الخلايا القاتلة الطبيعية حساسة جدا للإجهاد وتعتمد على التعرض المستمر لظروف فسيولوجية لتبقى قابلة للحياة ومستقرة خلال التجريب. و3) فحوصات القياسية لتحديد NK الخلايا السمية الخلوية، مثل التدرجات Ficoll 9 والافراج عن المقايسات 10، لا يعول عليها وغير متناسقة. التنوع الكامن من العينات البشرية تفاقم فقط هذه القضايا. العينات البشرية الطازجة التي تم جمعها خلال التدخلات التنظيم إلى حد ما ويصعب الحصول، على الأقل بالمقارنة مع العينات الحيوانية أو خطوط الخلايا خلد. وهذا يقلل من فرص تكرار التجارب أو إضافة المشاركين في مجموعة الدراسة للوصول إلى عتبات ذات دلالة إحصائية. بشكل جماعي، ودعم هذه القضايا الحاجة إلى وجود بروتوكول مبسط يسمح FOص كل من الإنتاجية العالية وتحليل عالية الموثوقية من NK نشاط الخلايا التحللي في العينات البشرية.أنشأنا سير العمل الذي يقصر الوقت اللازم لتحديد وعزل الخلايا واختبار NK من الدم الكامل البشري مع تقليل التعرض لعوامل خارجية. الطريقة المثلى لاستخدام أداتين، فارز مقرها المغناطيسي خلية وتدفق التصوير الكريات، و، إلى أقصى حد T-فحص معين: نسبة E للسماح للكشف عن ارتفاعات أو انخفاضات NK الخلايا السمية الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة يقيس بشكل مباشر على نشاط محدد من الخلايا القاتلة الطبيعية الفرد في الاستجابة للمؤثرات (في هذه الحالة بالذات، وممارسة لفترات طويلة). عادة، يتم عزل الخلايا القاتلة الطبيعية من دم واحد باستخدام تدرجات الكثافة أو الفرز الخلية باستخدام مز…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , (2001).
