共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

細菌や真菌培養の作製 真菌培養液の調製 ペトリ皿と同じ直径でセロハン膜を調製し、30分間、EDTA（脱イオン水中1 G / L）でそれらを沸騰。脱イオン水でシートを洗浄し、二度、それらをオートクレーブ。 EDTA前処理されたセロハン膜で覆われ、適切な寒天培地上での真菌の寒天プラグを接種することにより真菌の前培養を準備します。コロニーを、直径約1cmを得るために最適な成長温度でそれをインキュベートします。 L.二色 S238Nについては、diNH4酒石酸塩を0.5gからなるPachlewski P5寒天培地上で5日間、25℃でマルトースD 5 G + KH 2 PO 4で洗浄し、MgSO 4・7H 2 Oを0.5g、1gをインキュベート0.27グラム/ Lのモリブデンtrioxyde; 8.45グラム/ Lのホウ酸; 5 G /グルコースD +、10％チアミン塩酸1mlの1/10の希釈微量栄養素溶液（6グラム/ Lの硫酸第一鉄を1mlの20 gでLの男ganese硫酸塩; 5g / Lの硫酸銅。 2.27グラム/ Lの硫酸亜鉛）を脱イオン水で1リットルにしました。寒天の20グラム。 pHは5.5。 真菌の前培養から、コロニーの半径方向の拡張を促進するために低炭素寒天培地を含有するEDTA前処理されたセロハン膜で覆われた新しい寒天プレートに接種します。 ペトリ皿に接種するために、穏やかにメスで前培養からの真菌コロニーの（セルが同じ生理状態を持っている）外部領域を傷つけ、新しい寒天プレートに菌糸を移します。 新しいコロニーが直径約1cmになるまで、最適な成長温度でインキュベートします。 L.二色 S238Nについては、（P20寒天培地上で5日間25℃でディン4酒石酸0.25gのそれらをインキュベートし; KH 2 PO 4 0.5gを、 硫酸マグネシウム・7H 2 Oを0.25g;グルコースDを1g + 0.5 mlの10％のチアミン塩酸; 1/10希釈微量栄養素溶液0.5ml（CF 1.1.2。1）、脱イオン水で1リットルにしました。寒天の20グラム。 pHは5.5）。 注：これによりセロハン上の前培養物に、第二文化が中央プラグに寒天培地は含まれません。これらのプラグは、分析にバイアスを作成することができ、寒天や栄養素を導入するので、寒天プラグは、バイオフィルムのさらなる分析のために除去する必要があります。このステップの懸念維持し、伝播寒天プレート上で、それは胞子または凍結ストックから伝播される真菌のためには必要ではないされているだけの真菌種。 細菌培養物の調製 （使用した株に応じて、または任意の他の適切な媒体）に液体ルリア – ベルターニ（LB）培地25mlを適切な寒天培地上で培養物から2〜3個々の細菌コロニーを収集し、接種するために滅菌ループを使用してください。 P.は BBc6をオレッために、穏やかに振とうしながら28℃（〜150 rpm）で一晩培養をインキュベートします。 注：菌株を使用しましたこれは、顕微鏡観察の前に二重染色（真菌や細菌）を行う避けるので、GFPなどの蛍光タンパク質、でタグ付けされた、好ましいです。タイミング、攪拌速度、およびインキュベーションの温度は、使用する菌株、後期指数増殖培養を得るために、ある目標に依存しています。 真菌コロニー上の細菌のin vitroバイオフィルムで Nの調製遠心分離機3分間5000×gで細菌培養し、無菌の0.1 Mリン酸カリウム緩衝液（25グラム/ L KH 2 PO 4および2.78グラム/ LK 2 HPO 4、pHは5.8）25mlにペレットを中断すること。一度、この手順を繰り返し、同じ緩衝液で10 9細胞/ mlに最終細菌濃度を調整します。 細菌懸濁液（または陰性対照のための滅菌0.1 Mリン酸カリウム緩衝液）5mlで6ウェルマイクロプレートを埋めます。 フォンのセロファン膜をカット各膜上の単一の真菌コロニーをセロファンの正方形を取得するために滅菌カミソリの刃を持つアル文化。慎重にピンセットを用いて固形培地から菌糸を含むセロファンの正方形を削除し、細菌懸濁液を含むマイクロプレートのウェルにセロハン含む菌糸の正方形を転送します。 真菌のコロニーがまだセロハンに添付されていながら、静かにマイクロプレートを振ります。その後、プレートにおける真菌コロニーを残し、セロファンシートを削除します。 研究の微生物に適した温度で穏やかに攪拌（〜60回転）でマイクロプレートをインキュベートします。 注：インキュベーション時間を解析するバイオフィルムとステージの確立の速度に依存します。 P.についてBBc6 / Lをオレッ 。二色は、成熟したバイオフィルムを得るために早期のバイオフィルムを取得し、16時間までのために30分間20℃でインキュベートします。 バイオフィルム形式の3レーザー走査共焦点顕微鏡分析イオン 試料調製 菌糸に静電付着した浮遊性細菌や細菌を除去するには、強力な塩溶液の5ミリリットル（のNaCl、17グラム/ L）17が充填された新しい6ウェルマイクロプレートにそれを転送することにより、菌をすすぎます。静かに1分間振ります。 穏やかに2分間振盪、無菌の0.1 Mリン酸カリウム緩衝液5mlを含有する新しい6ウェルマイクロプレートに菌を移し、新鮮なリン酸カリウム緩衝液に菌を移します。 取得部は、真菌のコロニーの約半分を含むように、リン酸カリウム緩衝液中でそれを維持しながらメスで撮像される真菌のコロニーの一部を切断します。 サンプルを染色するために、適切な蛍光色素（分析の目的に応じて）を含有する滅菌水で満たされたペトリ皿にそれを転送し、暗闇の中でそれをインキュベートします。 真菌のネットワークを可視化するために、例えば、使用、コンゴレッド（0.1％最終共同アレクサフルオロ633（10 / mlの最終濃度、インキュベーションの10分）またはFUN1（10μMの最終濃度、インキュベーションの10分）に結合ncentration、インキュベーションの5分）、小麦胚芽agglutin（WGA）レクチン。 非蛍光タグ化細菌を使用している場合、多数の細胞浸透性DNA色素のうち、DNA特異的蛍光プローブによる細菌細胞は、市販の対比染色。例えば、DAPI（0.25 / mlの最終濃度、インキュベーションの10分）を使用します。 マトリックスタンパク質を可視化するために、タンパク質染色21を使用します 。 染色後、滅菌0.1 Mリン酸カリウムを10mlを含むペトリ皿の蓋にそれを転送することによって、試料をすすぎ、穏やかに1分間振とうします。 半分はシャーレのふたでスライドを沈めると微妙にスライドの上に浮いているように切断面をもたらします。そして、ゆっくりとサンプルをそっとスライド上に沈降させ、緩衝溶液からスライドを削除します。 <br />注：このステップでは、バイオフィルムの妨害を避けるために穏やかに進行することは非常に重要です。 最後に、試料に抗退色封入剤の10μlを添加し、カバーガラスでそれをカバーしています。 注意：スライドが用意されると、顕微鏡分析は、バイオフィルムの構造に変更を避けるために（最大でも30分以内）、できるだけ早く実行する必要があります。 共焦点顕微鏡分析 イメージングソフトウェアに結合された10倍または40倍の対物レンズで共焦点レーザー顕微鏡下でスライドを調べます。 注：ここでは、マルチビーム走査型共焦点顕微鏡405、488、及び561 nmの励起レーザ、のGaAsP PMT検出器、および10×0.3 NA及び40X 1.2 NA対物レンズを装備を使用しました。 要求されたデータの種類に、時間制約に適合したパラメータを用いて撮影を行います。使用汚れに、製造者のrecommendatiに係るレーザ励起/発光波長を使用しますアドオン。真菌のコロニーおよびバイオフィルムの世界的な3Dビューを得るために、タイルのスキャンおよびZ-スタック機能の組み合わせを使用してください。 注： 図3上の画像次のパラメーターを用いて取得した8ビット/ピクセルを、平均= 2、画素滞留= 1.58マイクロ秒、タイルがオンラインステッチ（10％カバレッジ、閾値= 0.7）と5×5の画像のスキャン。 Z-ステップ=2μmです。 3次元データの可視化のために、多くの無料または商用のソフトウェア（これらは3Dレンダリングのための多くのオプションを提供しています）のいずれかを使用します。 例えば、明視野チャンネルを減算し、2D最大強度投影としてZスタックデータの表示の明るさとコントラストを調整し、合成画像を作成するためのチャネルをマージします。それらが存在する場合、Zスタックの先端の信号なしにスライスをなくします。その後、2D最大強度投影を行い、RGBカラーに結果を変換します。画像pを得るために、ImageJソフトウェア22に「Zプロジェクト"機能を使用してください2D最大強度の投影によってここに憤慨。 4.電子顕微鏡分析ステップ3.1.2で除き、LSCMについて記載したように試料を調製すすぎ工程の後に滅菌水の代わりにリン酸カリウム緩衝液にバイオフィルムを移します。これは、SEM画像を乱すことになる脱水工程時に塩の結晶の形成を回避します。 試料ホルダーにバイオフィルムを移し、余分な水分を除去します。サンプルのみをカバーするために水の小さなペリクルを可能にします。 可変圧力走査型電子顕微鏡（VP-SEM）のチャンバーにサンプルを移します。ペルチェ冷却ステージ上で-50℃に凍結します。および15時間に設定された可変圧力の100 Paとして、直接SEMチャンバー内に、それはゆっくりと凍結乾燥をすることができます。 凍結乾燥が完了した後、サンプルを取り出し、高真空成膜装置にそれを転送します。コートplatinuの2ナノメートルを有するサンプルアルゴンプラズマ（2.5×10 -2ミリバール、35ミリアンペア）下メートル（石英測定）。 検出器とは1kVの電子ハイテンション」レンズの「高解像度を使用して、電界放出銃（FEG）を搭載したSEMでコーティングされたサンプルを観察します。