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Immunology and Infection

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Published: January 25, 2017
doi:
10.3791/54771
, , , , ,
1Interactions Arbres – Microorganismes, UMR1136,INRA Université de Lorraine, 2Ecologie et Ecophysiologie Forestières – PTEF, UMR 1137,INRA Université de Lorraine, 3Biosciences Division,Oak Ridge National Laboratory

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zu wachsen und qualitativ bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen durch konfokale und Elektronenmikroskopie analysiert.

Abstract

Bakterielle Biofilme häufig auf Pilzflächen bilden und kann in zahlreichen Bakterien-Pilz-Interaktionsprozesse, wie metabolische Kooperation, Konkurrenz oder predation beteiligt sein. Die Untersuchung von Biofilmen ist wichtig in vielen biologischen Bereichen, einschließlich der Umweltwissenschaften, Lebensmittelproduktion und Medizin. Jedoch haben nur wenige Studien über solche bakteriellen Biofilmen konzentriert, teilweise aufgrund der Schwierigkeit, sie zu untersuchen. Die meisten Methoden zur qualitativen und quantitativen Analysen Biofilm in der Literatur beschrieben sind nur geeignet für Biofilme auf abiotischen Oberflächen oder auf homogenen und dünnen biotischen Oberflächen, wie einer Monoschicht von Epithelzellen bilden.

Während konfokalen Laserrastermikroskopie (LSCM) oft in situ und in vivo Biofilmen verwendet wird , um zu analysieren, wird diese Technologie sehr schwierig , wenn zur bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen angewendet, aufgrund der Dicke und die drei Dimensionen des Hyphen networks. Um diesen Nachteil zu überwinden, entwickelten wir ein Protokoll mit einem Verfahren kombiniert Mikroskopie die Ansammlung von Hyphen Schichten in Pilzkolonien zu begrenzen. unter Verwendung von sowohl LSCM und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Mit dieser Methode konnten wir die Entwicklung von bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen auf verschiedenen Skalen zu untersuchen. Dieser Bericht beschreibt das Protokoll, einschließlich Mikroorganismenkulturen, bakterielle Biofilmbildung Bedingungen, Biofilm-Färbung und LSCM und SEM-Visualisierungen.

Introduction

Pilze und Bakterien haben viele Möglichkeiten, miteinander zu interagieren, weil sie in den meisten terrestrischen Umgebungen zusammenleben. Aufgrund ihrer Vielfalt und ihrer Allgegenwart, sind diese Wechselwirkungen wichtig in vielen biologischen Bereichen, einschließlich der Biotechnologie, Landwirtschaft, Lebensmittelverarbeitung und Medizin 1, 2. Molekulare Wechselwirkungen erfordern einen gewissen Grad der Nähe der Austausch zwischen den Partnern zu ermöglichen, und in einigen Fällen eine physikalische Assoziation der Partner ist , die für eine funktionelle Interaktion 3. Eine gemeinsame physikalische Assoziation zwischen Bakterien und Pilzen ist die Bildung von bakteriellen Biofilmen auf Pilzflächen 4. Dieser direkte Kontakt zwischen Bakterienzellen und Pilzhyphen ermöglicht intime Interaktionen, die in verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind. Zum Beispiel kann die Untersuchung der Biofilmbildung von Pseudomonas aeruginosa auf der Mög in der Medizin,tunistic Pilzpathogens Candida albicans konnte Einblicke in den Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung bieten und Virulenz 5. In der Landwirtschaft, Studien deuten darauf hin, dass die pflanzenwachstumsfördernden Rhizosphärenbakterien und biocontrol Bakterien haben eine erhöhte Effizienz, wenn sie mit einem Pilz in einem gemischten Biofilm verbunden. Zum Beispiel haben Bradyrhizobium elkanii N 2 -fixierender Aktivität verstärkt , wenn mit Pleurotus ostreatus in einem gemischten Biofilm 6 verbunden. Schließlich wird in der biologischen Sanierung, für die Sanierung von Altlasten Bakterien-Pilz gemischte Biofilme wurden 7, 8 verwendet.

LSCM ist besonders geeignet, Biofilme zu untersuchen, da sie für eine dreidimensionale Betrachtung ermöglicht mit minimalem Vorbehandlungen hydratisiert Biofilmen lebender, wodurch Biofilm Struktur und Organisation gehalten wird. So Biofilm Analyse von LSCM ist sehr informativ, besonders detERMINE den zeitlichen Verlauf der Biofilmbildung und die Detektion von charakteristischen Stufen 9, 10, von der Klebeschritt zur Entwicklung eines reifen Biofilms. Es ist auch besonders geeignet ist, die Biofilmstruktur und der Matrix 11, 12 sichtbar zu machen oder die Biofilm – Größe 13, 14 zu quantifizieren. Obwohl dieses Verfahren geeignet ist, Biofilme auf abiotische oder biotische dünnen Oberflächen zu untersuchen, auf einer Pilz-fädigen Kolonie bakteriellen Biofilm Studium ist immer noch sehr schwierig. Tatsächlich sind die meisten Fadenpilze bauen dicke, komplexe, dreidimensionale Netzwerke in der Kultur. Selbst wenn dicke Gegenstände können durch konfokale Mikroskopie, die Dämpfung der Laser Penetration und die Fluoreszenzemission oft verringern die Qualität der endgültigen Bilder über eine Tiefe von 50 & mgr; m 15 abgebildet werden. Da außerdem Pilzkolonien sind nicht starr, it ist schwierig, die Mikroorganismen zu behandeln, ohne die Biofilme zu stören. Aufgrund der Dicke der Proben werden die wenigen mikroskopische Analysen von bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen Regel nur auf einem kleinen Teil der Pilzkolonie durchgeführt, daher 16 nur wenige Hyphen enthält, 17, 18. All dies schränkt unsere Fähigkeit Biofilm Verteilung auf der Pilzkolonie zu beschreiben und damit Verzerrungen in die Analyse im Falle der heterogenen Verteilung des Biofilms in der Pilzkolonie bringen kann.

Um solche Schwierigkeiten zu überwinden, können wir ein Verfahren für das Wachstum und die Analyse von bakteriellen Biofilms auf Pilzhyphen. Diese Methode wurde angewandt , um die Biofilmbildung zu studieren , in Pseudomonas fluorescens BBc6 auf den Hyphen des Ektomykorrhiza basidiomycete Laccaria bicolor S238N. Diese beiden Wald-Boden-Mikroorganismen wurden zuvor beschrieben gemischt zu bildenBiofilm artigen Strukturen 19, 20. Dieses Verfahren kann leicht weiter zu anderen Fadenpilz / Bakterien-Systeme angepasst werden. Das hier vorgestellte Verfahren beruht auf der Kombination einer Pilzkulturverfahren basiert, so dass für das Wachstum von sehr dünnen Pilzkolonien mit LSCM und SEM-Bildgebung. Dies erlaubt uns Mikro- (& mgr; m-Bereich) und Meso- (mm-Bereich) Skala Blick auf die Interaktion zwischen den beiden Mikroorganismen zu erhalten, so dass für die qualitative Charakterisierung des Biofilms. Wir zeigten auch, dass die Proben mit SEM beobachtet werden kann, ermöglicht die Strukturanalyse des Biofilms im Nanoskalenniveau (nm-Bereich).

Protocol

1. Herstellung von Bakterien- und Pilzkulturen Herstellung von Pilzkulturen Bereiten Cellophan Membranen mit dem gleichen Durchmesser wie die Petrischalen und kocht sie in EDTA (1 g / l in entionisiertem Wasser) für 30 min. Spülen Sie die Blätter mit entsalztem Wasser und Autoklaven sie zweimal. Bereiten Sie eine Pilz-Vorkultur durch Inokulation von Pilz-Agar-Stecker auf dem entsprechenden Agar-Medium bedeckt mit einer EDTA vorbehandelt Cellophanmembran. Inkubieren es bei der optimalen Wachstumstemperatur Kolonien etwa 1 cm im Durchmesser zu erhalten. Für L. bicolor S238N, für 5 Tage auf Pachlewski P5 Agarmedium, hergestellt aus 0,5 g diNH4 Tartrat, 1 g KH 2 PO 4, 0,5 g MgSO 4 · 7H 2 O, 5 g Maltose D bei 25 ° C inkubieren + 20 g Glucose D +, 1 ml 10% Thiamin-HCl, 1 ml 1/10 verdünnt Mikronährstofflösung (6 g / l Eisensulfat, 0,27 g / L Molybdän trioxyde; 8,45 g / L Borsäure; 5 g / L MannMangansulfat; 5 g / L Kupfersulfat; 2,27 g / l Zinksulfat) hergestellt mit entsalztem Wasser auf 1 l; und 20 g Agar; pH-Wert 5,5. Von der Pilz-Vorkultur, impfen ein neues Agar-Platte mit dem Cellophanmembran vorbehandelt EDTA bedeckt eine kohlenstoffarme Agar-Medium, das die radiale Ausdehnung der Kolonien zu fördern. Um die Petrischale impfen, kratzen sanft den Außenbereich (wo Zellen die gleichen physiologischen Zustand haben) einer Pilzkolonie aus der Vorkultur mit einem Skalpell und übertragen Sie die Hyphen auf die neue Agarplatte. Inkubieren bei der optimalen Wachstumstemperatur, bis die neuen Kolonien etwa 1 cm im Durchmesser sind. Für L. bicolor S238N, inkubieren bei 25 ° C für 5 Tage auf P20 – Agar – Medium (0,25 g Dinh 4 Tartrat; 0,5 g KH 2 PO 4, 0,25 g MgSO 4 · 7H 2 O; 1 g Glucose + D ; 0,5 ml 10% Thiamin-HCl, 0,5 ml 1/10 verdünnt Mikronährstofflösung (cf 1.1.2.1) ein, füllt auf 1 l mit VE-Wasser; und 20 g Agar; pH 5.5). Hinweis: Wegen der Vorkultur auf Cellophan, wird die zweite Kultur nicht enthalten Agarmedien in den zentralen Stecker. Die Agar-Stecker sollten für eine weitere Analyse der Biofilm entfernt werden, da diese Stecker einführen Agar und Nährstoffe, die Vorurteile in der Analyse erstellen können. Dieser Schritt betrifft nur Pilzspezies, die auf Agarplatten gehalten und vermehrt, und es ist nicht notwendig, für Pilze, die aus Sporen oder gefrorene Bestände ausbreiten. Zubereitung von Bakterienkulturen Eine sterile Schleife 2 bis 3 einzelne Bakterienkolonien aus einer Kultur auf dem geeigneten Agarmedium zu sammeln und zu inokulieren 25 ml flüssigem Luria-Bertani (LB) -Medium (oder einem anderen geeigneten Medium, abhängig von dem verwendeten Stamm). Für P. BBc6 fluorescens, eine Nacht – Kultur bei 28 ° C unter leichtem Schütteln (~ 150 rpm) inkubiert. Hinweis: Um einen Stamm verwendenfluoreszierendes Protein, wie GFP getaggt mit, bevorzugt, da dies vermeidet eine Doppelfärbung (Pilze und Bakterien) Durchführen vor der mikroskopischen Beobachtungen. Der Zeitpunkt, die Rührgeschwindigkeit und die Temperatur der Inkubation hängen von dem verwendeten Stamm, dem Ziel, eine Kultur im Spät exponentielles Wachstum zu erzielen ist. 2. Herstellung von N In Vitro Biofilm von Bakterien auf der Pilzkolonie Zentrifuge die Bakterienkultur bei 5000 × g für 3 min und suspendieren das Pellet in 25 ml sterilem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (25 g / L KH 2 PO 4 und 2,78 g / LK 2 HPO 4, pH 5,8). Wiederhole diesen Schritt einmal und stellen die endgültige Bakterienkonzentration auf 10 & sup9 ; Zellen / ml mit dem gleichen Puffer. Füllen einer 6-well Mikrotiterplatte mit 5 ml der Bakteriensuspension (oder sterile 0,1 M Kaliumphosphatpuffer für die Negativkontrolle). Schneiden Sie die Cellophanmembran des Fungal Kultur mit einer sterilen Rasierklinge Quadrate aus Zellophan zu erhalten mit einer einzigen Pilzkolonie auf jeder Membran. die Zellophan Quadrate Hyphen von dem festen Medium Pinzette und übertragen Sie das Quadrat aus Cellophan enthält Hyphen auf eine Vertiefung der Mikrotiterplatte die Bakteriensuspension, enthaltend vorsichtig entfernen. Schütteln Sie die Mikrotiterplatte während die Pilzkolonien noch mit dem Cellophan gebunden sind; Entfernen Sie dann die Zellophanlagen, die Pilzkolonien in der Platte zu verlassen. Inkubieren der Mikrotiterplatte unter leichtem Schütteln (~ 60 Upm) bei einer Temperatur um den untersuchten Mikroorganismen angepasst. Hinweis: Die Zeit der Inkubation auf die Geschwindigkeit der Einrichtung des Biofilms und der Bühne zu analysierenden abhängt. Für P. fluorescens BBc6 / L. bicolor, für 30 min bei 20 ° C inkubieren Frühstadium Biofilmen zu erhalten und zu 16 h bis Biofilmen reifen zu erhalten. 3. Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie Analyse der Biofilm-FormatIon Probenvorbereitung Zum Entfernen von planktonischen Bakterien und Bakterien elektrostatisch an den Hyphen, spülen Sie den Pilz durch sie zu einem neuen 6-well Mikrotiterplatten gefüllt mit 5 ml einer starken Salzlösung (NaCl, 17 g / l) 17 zu übertragen; sanft schütteln für 1 min. Bringen Sie den Pilz zu einem neuen 6-well Mikrotiterplatten 5 ml sterilem 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer, sanft schütteln für 2 min und übertragen den Pilz an die frische Kaliumphosphat-Puffer. Schneiden Sie das Teil der Pilzkolonie mit einem Skalpell abgebildet werden, während sie in dem Kaliumphosphatpuffer, gehalten wird, so dass der erhaltene Abschnitt etwa die Hälfte der Pilzkolonie enthält. Um die Probe zu färben, dann in eine Petrischale gefüllt mit sterilem Wasser einen geeigneten fluoreszierenden Farbstoff enthält (je nach Ziel der Analyse), und brüten sie im Dunkeln. Um den Pilz-Netzwerk verwenden, zum Beispiel, Kongo-Rot (0,1% letzte Co visualisierenncentration, 5 min Inkubation), Weizenkeim agglutin (WGA) Lectin konjugiert Alexa Fluor 633 (10 ug / ml Endkonzentration, 10 min Inkubation) oder FUN1 (10 uM Endkonzentration, 10 min Inkubation). Wenn ein nicht-fluoreszierend-markiertes Bakterium unter Verwendung Gegenfärbemittel die Bakterienzellen mit einem DNA-spezifischen Fluoreszenzsonde unter den zahlreichen Zell-permeierenden DNA Farbstoffe im Handel erhältlich. Verwenden Sie zum Beispiel DAPI (0,25 ug / ml Endkonzentration, 10 min Inkubation). Um die Matrixproteine zu visualisieren, verwenden Sie ein Protein Fleck 21. Nach dem Färben, spülen Sie die Probe, indem sie es in eine Petrischale Deckel mit 10 ml sterilem 0,1 M Kaliumphosphat und sanft schütteln für 1 min zu übertragen. Die Hälfte eine Folie in der Schalendeckel Petri versenken und zart die Schnittfläche über dem Schlitten zu schweben bringen. Dann wird langsam die Folie aus der Pufferlösung zu entfernen, so dass die Probe sanft auf dem Objektträger absetzen. <br /> Hinweis: Für diesen Schritt ist es sehr wichtig sanft ablaufen Biofilm Störung zu vermeiden. Schließlich, fügen Sie 10 ul Anti-Fading Eindeckmedium auf die Probe und decken Sie es mit einem Deckglas. Hinweis: Wenn der Schieber hergestellt wird, muß die mikroskopische Analyse so schnell wie möglich durchgeführt werden (innerhalb von höchstens 30 min) zu vermeiden Modifikation in der Biofilm-Struktur. Konfokalmikroskopische Analyse Untersuchen Sie die Folien unter einem konfokalen Lasermikroskop mit einem 10X oder 40X Objektiv gekoppelt Imaging-Software. Anmerkung: Dabei ist ein Mehrstrahl-Abtastsystem konfokales Mikroskop mit 405, 488 und 561 nm Anregungslaser, ein GaAsP PMT-Detektor und 10X 0,3 NA und 40X 1,2 NA Ziele verwendet. Führen Abbildungsparameter unter Verwendung der Art von Daten angepasst angefordert und an die Zeitzwänge. Verwenden Sie die Laseranregung / Emissionswellenlängen entsprechend der Fleck verwendet und an den Herstellerempfehlungen,ons. Verwenden Sie eine Kombination von Fliesen Scan und die Z-Stack-Funktionen globalen 3D-Ansichten der Pilzkolonie und den Biofilmen zu erhalten. Hinweis: Bilder auf 3 erworben wurden folgende Parameter verwendet: 8-Bit / Pixel, Mittelwertbildung = 2, Pixel – Verweilzeit = 1,58 & mgr; s, Fliesen von 5×5 Bilder mit Online – Stitching – Scan (10% Deckung, Schwelle = 0,7); Z-Stufe = 2 um. Für die 3D-Visualisierung von Daten, verwenden Sie einen der vielen freien oder kommerziellen Software (diese bieten viele Möglichkeiten für die 3D-Rendering). Zum Beispiel, Z-Stack-Daten als 2D-Maximum Intensity Projections, subtrahieren Sie die Hellfeldkanal, passen Sie die Helligkeit und den Kontrast anzuzeigen und Kanäle verschmelzen, um ein zusammengesetztes Bild zu erstellen. Wenn sie vorhanden sind, zu beseitigen Scheiben ohne Signal an den Z-Stack Extremitäten. Führen Sie dann eine 2D-Maximum-Intensitätsprojektion und wandeln das Ergebnis in RGB-Farbe. Verwenden Sie die "Z – Projekt" -Funktion in der ImageJ Software 22 um die Bilder zu p erhaltenhier durch 2D maximale Intensität Projektionen übel genommen. 4. Elektronenmikroskopie-Analyse Bereiten Sie die Proben wie für LSCM beschrieben, außer in Schritt 3.1.2, übertragen Sie die Biofilme zu sterilem Wasser anstelle von Kaliumphosphat-Puffer nach den Spülschritten. Dies vermeidet die Bildung von Salzkristallen während der Entwässerungsstufe, die SEM-Bildgebung stören würde. Übertragen Sie die Biofilme zu einem Probenhalter und entfernen Sie überschüssiges Wasser; erlauben nur einen kleinen Häutchen von Wasser, um die Probe zu bedecken. Übertragung der Probe in die Kammer eines variablen Druck Rasterelektronenmikroskop (VP-SEM); einfrieren bis -50 ° C auf einem Peltier-Kühlstufe; und lassen Sie ihn langsam gefrier trocken, direkt in der REM-Kammer, mit 100 Pa variabler Druck gesetzt für 15 Stunden. Nach Beendigung der Gefriertrocknung, Abrufen der Probe und gibt sie in eine Filmabscheidungssystem Hochvakuum. Bestreichen Sie die Probe mit 2 nm von Platinum (Quarz – Messung) unter Argonplasma (2,5 x 10 -2 mbar, 35 mA). Achten Sie auf die beschichtete Probe mit einem mit einer Feldemissionskanone ausgestattet SEM (FEG), um die hohe Auflösung "in der Linse" Detektor und eine elektronische Hochspannung von 1 kV verwenden.

Representative Results

Die schematische Gesamt Verfahren der Pilzkultur und Biofilm Herstellung sind in Abbildung 1 wiedergegeben. Die Kultur – Methode erlaubt uns ein paar Schichten von Hyphen Pilzkolonien 20 bis 50 um dick zu erhalten , die, so dass Mikro- und Meso-Skala von hydrierten lebenden Biofilmen Analysen unter Verwendung von LSCM. Die Anwendung der Methode erlaubt den Erwerb von qualitativ hochwertigen Bildern von P. fluorescens BBc6 Biofilme auf L. bicolor Hyphen entlang der Bildung des Biofilms (Abbildungen 2-4). Die meso-scale Analyse der Biofilme demonstriert die heterogene Verteilung des Biofilm von P. fluorescens BBc6 auf der Hyphen von L. bicolor S238N (2 und 3). Meso-Scale – Analyse auch für die Verfolgung der Biofilmbildung im Laufe der Zeit (Abbildung erlaubt3) aus den frühen Stufen, in denen nur einige Bakterien Hyphen (3a befestigt wurden), was zur Bildung eines dicken, reifen Biofilm (Abbildung 3b). Die hohe Auflösung der mesoskaligen Images erlaubt uns im Mikromaßstab Analyse auf den gleichen Bildern , um die Kolonie – Architekturen (Abbildung 3c – d) ausführen zu erhalten. Die Mikro-Scale-Analyse mit spezifischen Markierung kombiniert ermöglichte uns einen Schritt weiter in der Biofilm Charakterisierung zu gehen. Hier SYPRO Rubin 23, die die meisten Klassen von Proteinen Etiketten, wurde auf die Proben aufgetragen (Figur 4) und zeigt das Vorhandensein von Proteinen in der Matrix. Schließlich weitere Einzelheiten der Biofilmstruktur wurden durch SEM Abbildung der gleichen Probe nach der Dehydratisierung und Beschichtung (5) erhalten. REM-Aufnahmen zur Verfügung gestelltZugriff auf den Nanometer-Bereich, was somit den Zugriff auf die Matrixstruktur. Abbildung 1: Gesamtschematische Verfahren der Pilzkultur und Biofilm Vorbereitung. Diese Zahl beschreibt die wichtigsten Schritte des Verfahrens von Mikroorganismenkulturen Analysen zu probieren. Weitere Einzelheiten sind im Protokoll angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: BBc6 Biofilm repartition auf der Pilzkolonie. Die Probe wurde nach 18 Stunden der Interaktion bei 10-facher Vergrößerung abgebildet. Das Bild wurde durch 2D-Maximum Intensity Projection von 3D-konfokale Mikroskopie-Aufnahmen erhalten. Das graue Gitter auf dem figuRe zeigt die Mosaik-Positionen. L. bicolor Hyphen mit Kongo – Rot (rot) und Bakterien sind GFP-markierten (grün) gefärbt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Frühe und späte Stadien der BBc6 Biofilmbildung auf L. bicolor Hyphen. Dieses Bild wurde über 2D Maximum Intensity Projection von 3D-konfokale Mikroskopie-Aufnahmen erhalten. Bildgebung wurde bei 40-facher Vergrößerung vorgenommen. (A) Biofilme repartition nach 2 h Interaktion. (B) Biofilm repartition nach 14 Stunden der Interaktion. (C) Die Erweiterung des weißen Rechtecks in (a). (D) Die Erweiterung des weißen Rechtecks in (b). Pilzhyphen sind gefärbt mit Kongo-Rot (rot) und Bakterien sind GFP-tagged (grün). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 4: Matrix – Färbung von BBc6 Biofilm auf L. bicolor Hyphen. (A) Biofilme nach 16 Stunden der Interaktion. (B) Die Erweiterung des weißen Rechtecks in (a). Imaging wurde bei 40-facher Vergrößerung durchgeführt, und diese Bilder wurden über 2D Maximum Intensity Projection von 3D-konfokale Mikroskopie-Aufnahmen erhalten. Bakterien sind GFP-markierten (grün), Pilz mit Fun1 (dunkelgrün) gefärbt, und Proteine ​​mit S. Rubin (rot) gefärbt werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <p class= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Abbildung 5: REM – Aufnahmen von BBc6 Biofilme auf L. bicolor Hyphen. 1kV: REM-Bildgebung wurde bei 2360X, EHT ausgeführt. Vor der Bildgebung wurde die Probe langsam in der SEM Kammer gefriergetrocknet und mit Platin beschichtet. Grüne Pfeile zeigen auf bakterielle Biofilme und gelbe Pfeile auf Pilzhyphen zeigen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Bakterielle Biofilme sind in vielen Umgebungen abgerufen und sind seit den 1950er Jahren untersucht worden, um die Entwicklung einer Reihe von Verfahren führt sie 24 zu analysieren. Klassische Methoden zur Quantifizierung und Monitor Biofilme umfassen Mikrotiter-Assays und die am häufigsten verwendete Methode, Kristallviolett (CV) Färbung. Diese Verfahren sind schnell, kostengünstig und leicht zu handhaben und 25 sind besonders nützlich Gesamt Biofilm Biomasse zu quantifizieren oder die Lebensfähigkeit und Matrixquantifizierungsassays durchzuführen. Auf einer anderen Seite "omics" Methoden sind auch in der Biofilm Studien nützlich, so dass für quantitative und funktionelle Analysen von Biofilmen 26, 27. Trotz der Vorteile der Mikrotiterplatte und "omics" Methoden, einige wesentliche Merkmale von Biofilmen kann nicht mit diesen Techniken erfasst werden, ein vollständiges Verständnis dieses Prozesses zu behindern. Solche Funktionen sind Matrixstrukturs, Bakterienkolonie Architekturen, Zell / Zell-Wechselwirkungen und Besiedlungsmuster, die das Funktionieren von Biofilmen für das Verständnis der Schlüsseldaten sind beide und die Dynamik ihrer Entstehung. Trotz der Kapazität der Mikroskopie diese Funktionen, Mikroskopie Analyse von bakteriellen Biofilmen auf Fadenpilze zu erfassen sind noch rar. Dies ist vor allem auf das Wachstum von Fadenpilzen, die oft Kolonien von dicken, komplexen, dreidimensionalen Netzwerke bildet. Die Bildung von bakteriellen Biofilmen auf Pilzen ist üblich , in verschiedenen Umgebungen und ist deutlich in verschiedenen Bereichen 4 beteiligt (zB Medizin, Landwirtschaft und Umwelt.); Daher ist es wichtig, neue Methoden zu entwickeln, um die Untersuchung zu erleichtern. Zu diesem Zweck kombiniert wir ein Verfahren sehr dünne Pilzkolonien mit mikroskopischer Abbildung der bakteriellen Biofilmen zu erzeugen. Darüber hinaus haben wir vorgeschlagen, eine Reihe von Mikroskopie-Tools qualitativ diese Biofilme zu analysieren. Der Erfolg des Verfahrens beruht aufdie Fähigkeit, sehr dünne Hyphen Kolonien zu produzieren und die entsprechenden Farbstoffe anzuwenden. Diese Punkte werden im Folgenden erörtert.

Aufgrund der komplexen Strukturen der Biofilme, erfordert ihre Funktion zu verstehen , 28 eine Multi-Scale – Ansatz, 29. Verteilungsmuster der Biofilme, Bakterienkolonie Architektur und Matrixstruktur und Zusammensetzung sind in verschiedenen Maßstäben (dh meso-Maßstab und im Mikromaßstab) analysiert. Außerdem ermöglicht nanoskalige Auflösung Zugriff auf die Zell / Zell-Wechselwirkungen und der physikalischen Nanostruktur der Matrix. Somit ermöglicht die entwickelte Methode leicht eine Multiskalen-Analyse der Bakterien auf der Pilzkolonie gebildet Biofilmen.

In den meisten Studien analysiert LSCM von Biofilmen an den Mikromaßstab beschränkt, die meso-scale üblicherweise durch optische Kohärenztomographie 30 durchgeführt wird, 31, <supclass = "xref"> 32. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht sowohl Mikro- und Meso-Scale-Analysen von LSCM. Es veranschaulicht die Nützlichkeit der Kombination von sowohl in dem gleichen Bereich der Probe analysiert und sogar auf dem gleichen Bild unter Verwendung der neuen Generation konfokalen Mikroskopen mit hoher Auflösung (Abbildung 3). So zu kompilierten Daten verknüpft Fragen gesammelt in verschiedenen Maßstäben mit unterschiedlichen Methoden, die hier vermieden werden.

Diese Kombination von Analysen gaben Zugriff begleitend zum Biofilm repartition auf der Pilzkolonie, die Bakterienkolonie Architektur entlang des sich entwickelnden Biofilm, und der Matrix-Struktur. Die meso-scale – Analyse zeigte eine heterogene Verteilung der bakteriellen Biofilmen auf den Pilzkolonien (2 und 3). Diese Beobachtung würde nicht möglich gewesen, mit Protokollen, die nur Abbilden eines kleinen Teils der Pilzkolonie ermöglichen, die repräsentativ für die gesamte Kolonie nicht zwingend ist. Somit wird, währendoft vernachlässigt wird, kann die Meso-Scale-Analyse wertvolle Informationen über Muster Biofilm Verteilung geben.

Schließlich kann das entwickelte Verfahren verwendet werden, Proben zu analysieren, mit verschiedenen Mikroskopietechniken, einschließlich der Rasterelektronenmikroskopie. Hier wurde SEM verwendet, um die Nanomaßstab zu erreichen und die bakterielle räumliche Organisation innerhalb des Biofilms zu erhalten. Es entwickelte sich sehr gut mit den dünnen Pilzkolonien, während SEM nur Oberflächenabbildung erlaubt. Im Gegensatz zu LSCM, SEM jedoch erforderlich Probe Dehydratisierung und, am häufigsten, die Beschichtung mit einem leitenden Metall. Diese Entwässerungsprozess kann biologische Strukturen verändern, wenn er nicht richtig ausgeführt und Optimierung erfordern. Hier Probe Dehydrierung langsam Lyophilisation wurde unter Verwendung 33 verwendet. Dennoch werden sowohl LSCM und SEM den Proben Anlegen der Leistung korrelative Mikroskopie am gleichen Ort der Probe ermöglichen.

Trotz der Vorteile,oben beschrieben, gibt es einige Einschränkungen. Erstens kann es nicht auf alle Arten von Pilzen anwendbar. Tatsächlich ist diese Kultivierungsverfahren für Pilze entwickelten sich radial auf der Oberfläche der festen Medien ausbreitet. Dieses Verfahren kann für Pilze nicht geeignet sein , hauptsächlich Lufthyphen bilden (zB Fusarium sp.) Oder für mikroaerobe Pilze hauptsächlich innerhalb Agar zu verbreiten. Außerdem können Pilze erniedrigender Zellophan problematisch sein , wie gut (z. B. Trichoderma sp.). Zweitens ist es wichtig zu beachten, dass die Färbung Strategie ein kritischer Punkt ist und die Wahl des Flecks muss sorgfältig vorgenommen werden, da der Fleck nicht den Biofilm stören muss. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass Calcofluor Weiß Teil Biofilm Störung (Daten nicht gezeigt) verursacht wird, wahrscheinlich aufgrund des hohen pH-Wert dieser Fleck. Auch einige Farbstoffe hergestellt heterogene Färbung (z. B. Kongorot), während andere erzeugte homogene Färbung (z. B. Zellwand Färbung mit WGA – Lektin), ein heterogenes Bildqualität.Darüber hinaus ist es wichtig, sich bewusst zu sein, dass einige Farbstoffe nicht völlig spezifisch sein könnten. Zum Beispiel WGA Flecken nicht nur Pilzzellwände , sondern auch N-Acetylneuraminsäure in gram-positive Bakterienzellwände und Adhäsine durch gram-positive und -negative Bakterien während der Biofilmbildung 34 erzeugt, 35. Daher ist die Verwendung fluorescent protein-markierten Bakterien und / oder Pilzen, empfohlen wird, um mehrere Färbungs zu vermeiden. Wenn mehrere Farbstoffe verwendet werden, müssen sie chemisch nicht stören und ihre Emissionsspektren nicht überlappen.

Meso-Scale-Analysen eine große Scanbereich erfordern und daher LSCM kann zeitaufwendig (40 min bis 1 h, abhängig von der Probendicke) und Engpass die Analyse einer großen Anzahl von Proben sein. Dennoch können Anpassungen in Abhängigkeit von der Art der Daten durchgeführt werden benötigt. Es ist möglich, Aufnahmezeit und die Bildgröße zu verringern, indem die Bildqualität zu ändern. Beispielsweise hochauflösendeist nicht erforderlich, den Biofilm allgemeinen repartition zu analysieren.

Schließlich müssen einige Einschränkungen berücksichtigt werden bei der Auswahl der Z- Stapeldaten als 2D- oder 3D-Projektionen angezeigt werden soll. Zweidimensionale Projektionen sind eine gute Möglichkeit, Daten zusammenzufassen, aber ausführliche Informationen verloren, und überlappende Strukturen werden ausgeblendet. Auf der anderen Seite ermöglichen 3D-Projektionen die Visualisierung von verschiedenen Blickwinkeln, aber sie oft machen schlecht bei räumlicher Komplexität.

Abschließend haben wir ein Verfahren zur Charakterisierung von bakteriellen Biofilmen auf Hyphen auf struktureller Ebene berichtet. Die Methode kann auch auf andere Anwendungen erweitert werden. Tatsächlich ermöglicht dieses Verfahren die Durchführung von funktionellen oder chemische Charakterisierung von bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen bilden. Aufgrund der großen Vielfalt der vorhandenen fluoreszierenden Reporter – Systemen können LSCM Analyse für mehrere Zwecke 29 verwendet werden. Zum Beispiel kann die Fluoreszenz microscopy könnte verwendet werden , um pH – Gradienten 36 oder Moleküldiffusion in Biofilmen 37 überwachen. Darüber hinaus ermöglicht das Verfahren für die Gemeinschaftsanalyse in Multispezies Biofilmen. Beispielsweise Fluoreszenz in situ Hybridisierung spezifischen Bakteriengruppen Targeting ist besonders nützlich , bestimmte bakterielle repartition in Mehr – Arten 38, 39 Biofilme zu untersuchen. Schließlich können zahlreiche fluoreszierende Farbstoffe verwendet werden , um die Matrixzusammensetzung der Biofilme 21 zu charakterisieren. Hier wurden die Proteine unter Verwendung von Sypro gezielte, die einen großen Bereich von Proteinen anfärbt, darunter Matrixproteine (Abbildung 4), aber auch andere Farbstoffe ermöglichen die Sichtbarmachung von anderen wichtigen Matrixbestandteile, wie Exopolysaccharide oder extrazelluläre DNA. Interessanterweise all diese Analysen an der meso-Maßstab durchgeführt werden, um die beschriebenen Verfahren. Da LSCM auf lebende Proben durchgeführt werden,es ist auch möglich, Zeitraffer-Bildgebung unter Verwendung von zum Beispiel coverwell Kammern, besonders geeignet für dünne Pilzkolonien zu erreichen. Diese Option ist besonders interessant, da die Biofilmbildung ein komplexer, dynamischer Prozess ist. Schließlich ist für eine quantitative Zweck kann das beschriebene Verfahren die Genauigkeit der automatischen quantitativen Analyse zu verbessern, indem diese Quantifizierung ermöglicht, auf meso Stufenbilder. Dies kann Biofilm Heterogenität und statistische Probleme überwinden 29.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the French National Research Agency through the Laboratory of Excellence ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), the Plant-Microbe Interfaces Scientific Focus Area in the Genomic Science Program, and the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. Oak Ridge National Laboratory is managed by UT-Battelle, LLC, for the United States Department of Energy under contract DE-AC05-00OR22725.

Materials

6 well Falcon Tissue Culture Plates Fisher Scientific 08-772-33 Used in 2.2 & 3.1
Congo Red Fisher Scientific C580-25 Used in 3.1.4.1
FUN 1 Cell Stain Thermo Fisher Scientific F7030 Used in 3.1.4.1
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 Used in 3.1.4.1
DAPI solution Thermo Fisher Scientific 62248 Used in 3.1.4.2
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 Used in 3.1.4.3
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain Thermo Fisher Scientific F10318 Used in 3.1.4.4
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Used in 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1 Zeiss Used in 3.2.1
ZEN 2.1 lite black software  Zeiss Used in 3.2.1
High Vacuum Coater Leica EM ACE600 Leica Used in 4
GeminiSEM-FEG Zeiss Used in 4
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References

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Miquel Guennoc, C., Rose, C., Guinnet, F., Miquel, I., Labbé, J., Deveau, A. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e54771, doi:10.3791/54771 (2017).
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