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Immunology and Infection

Une nouvelle méthode d'analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Published: January 25, 2017
doi:
10.3791/54771
, , , , ,
1Interactions Arbres – Microorganismes, UMR1136,INRA Université de Lorraine, 2Ecologie et Ecophysiologie Forestières – PTEF, UMR 1137,INRA Université de Lorraine, 3Biosciences Division,Oak Ridge National Laboratory

Summary

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour développer et analyser qualitativement les biofilms bactériens sur les hyphes fongiques par microscopie confocale et électronique.

Abstract

Les biofilms bactériens se forment fréquemment sur les surfaces fongiques et peuvent être impliqués dans de nombreux processus d'interaction bactérienne, fongique tels que la coopération métabolique, la concurrence ou la prédation. L'étude de biofilms est important dans de nombreux domaines biologiques, y compris les sciences de l'environnement, la production alimentaire, et de la médecine. Cependant, peu d'études ont porté sur ces biofilms bactériens, partiellement en raison de la difficulté de les étudier. La plupart des procédés de biofilm analyses qualitatives et quantitatives décrites dans la littérature ne conviennent que pour des biofilms sur des surfaces formant abiotiques ou biotiques minces homogènes et de surfaces, par exemple une monocouche de cellules épithéliales.

Lors de la numérisation laser microscopie confocale (MCCL) est souvent utilisé pour analyser in situ et dans les biofilms in vivo, cette technologie devient très difficile lorsqu'il est appliqué à des biofilms bactériens sur les hyphes fongiques, en raison de l'épaisseur et les trois dimensions de la netw des hyphesorks. Pour pallier cette lacune, nous avons développé un protocole combinant la microscopie avec une méthode pour limiter l'accumulation de couches de hyphes dans les colonies fongiques. En utilisant cette méthode, nous avons pu étudier le développement de biofilms bactériens sur les hyphes fongiques à des échelles multiples à l'aide de la microscopie électronique à MCCL et balayage (MEB). Ce rapport décrit le protocole, y compris les cultures de micro-organismes, les conditions de formation de biofilm bactérien, biofilm coloration et MCCL et visualisations SEM.

Introduction

Les champignons et les bactéries ont de nombreuses occasions d'interagir les uns avec les autres parce qu'ils cohabitent dans la plupart des environnements terrestres. En raison de leur diversité et de leur omniprésence, ces interactions sont importantes dans de nombreux domaines biologiques, y compris la biotechnologie, l' agriculture, la transformation des aliments, et de la médecine 1, 2. Interactions moléculaires nécessitent un certain degré de proximité afin de permettre les échanges entre les partenaires, et dans certains cas, une association physique des partenaires est nécessaire pour une interaction fonctionnelle 3. Une association physique commune entre les bactéries et les champignons est la formation de biofilms bactériens sur les surfaces fongiques 4. Ce contact direct entre les cellules bactériennes et les hyphes fongiques permet des interactions intimes qui sont impliqués dans divers processus biologiques. Par exemple, en médecine, dans l'étude de la formation de biofilm de Pseudomonas aeruginosa sur la opporpathogènes fongiques opportunistes Candida albicans pourraient fournir des indications sur le lien entre la formation de biofilm et la virulence 5. Dans l'agriculture, des études suggèrent que la croissance des plantes rhizobactéries et biocontrôle bactéries ont une efficacité accrue lorsqu'elle est associée à un champignon dans un biofilm mixte. Par exemple, elkanii Bradyrhizobium ont amélioré N 2 activité fixatrices lorsqu'elle est associée à Pleurotus ostreatus dans un biofilm mixte 6. Enfin, dans la biorestauration, biofilms mixtes bactérienne-fongiques ont été utilisées pour l'assainissement des sites pollués 7, 8.

LSCM est particulièrement adaptée à l'étude des biofilms, car il permet une observation en trois dimensions de la vie biofilms hydraté avec prétraitements minimum, ce qui maintient la structure et de l'organisation biofilm. Ainsi, l'analyse de biofilm par MCCL est très instructif, surtout à detERMINE l'évolution temporelle de la formation du biofilm et la détection des étapes caractéristiques 9, 10, de l'étape d'adhérence sur le développement d'un biofilm mature. Il est également particulièrement adaptée pour visualiser la structure de biofilm et de la matrice 11, 12 ou de quantifier la taille du biofilm 13, 14. Bien que cette méthode est adaptée à l'étude des biofilms sur des surfaces biotiques abiotiques ou minces, étudier biofilm bactérien sur une colonie de champignon filamenteux est encore très difficile. En effet, la plupart des champignons filamenteux construire épaisses, complexes, des réseaux tridimensionnels en culture. Même si les objets épais peuvent être imagées par microscopie confocale, l'atténuation de la pénétration du laser et l'émission de fluorescence diminue souvent la qualité des images finales sur une profondeur de 50 um 15. De plus, parce que les colonies de champignons ne sont pas rigides, it est difficile à manipuler les micro-organismes sans déranger les biofilms. En raison de l'épaisseur des échantillons, les quelques analyses microscopiques des biofilms bactériens sur les hyphes fongiques sont généralement effectuées sur une petite partie de la colonie fongique, contenant donc que quelques hyphes 16, 17, 18. Tout cela limite notre capacité de décrire la distribution de biofilm sur la colonie fongique et peut ainsi apporter des biais dans l'analyse en cas de répartition hétérogène du biofilm au sein de la colonie fongique.

Pour surmonter ces difficultés, on rapporte un procédé pour la croissance et l'analyse du biofilm bactérien sur les hyphes fongiques. Cette méthode a été appliquée à l' étude de la formation de biofilms dans Pseudomonas fluorescens BBc6 sur les hyphes du basidiomycète ectomycorhizien Laccaria bicolor S238N. Ces deux micro-organismes forêt-sol ont été décrits précédemment pour former mixtebiofilm-like structures 19, 20. Ce procédé peut être facilement adapté en outre à d'autres systèmes fongiques / bactériennes filamenteuses. La méthode présentée ici est basée sur la combinaison d'un procédé de culture de champignons, ce qui permet la croissance des colonies fongiques très minces, avec MCCL et l'imagerie SEM. Cela nous a permis d'obtenir des micro- (plage um) et méso (plage de mm) échelle des vues sur l'interaction entre les deux micro-organismes, ce qui permet pour la caractérisation qualitative du biofilm. Nous avons également montré que les échantillons peuvent être observés avec SEM, ce qui permet une analyse structurelle du biofilm au niveau nano-échelle (gamme de nm).

Protocol

1. Préparation de cultures bactériennes et fongiques Préparation des cultures fongiques Préparer des membranes de cellophane avec le même diamètre que les boîtes de Pétri et les faire bouillir dans de l'EDTA (1 g / litre dans de l'eau déminéralisée) pendant 30 min. Rincez les feuilles avec de l'eau déminéralisée et autoclave les deux fois. Préparer un pré-culture fongique par inoculation fongique agar bouchons sur le milieu de gélose appropriée recouverte d'une membrane de cellophane EDTA prétraité. Incuber à la température optimale de croissance pour obtenir des colonies d'environ 1 cm de diamètre. Pour L. bicolor S238N, on incube à 25 ° C pendant 5 jours sur un milieu d'agar Pachlewski P5, faite de 0,5 g de diNH4 tartrate, 1 g de KH 2 PO 4, 0,5 g de MgSO 4 7H 2 O, 5 g de maltose D + , 20 g de glucose D + 1 ml de 10% de thiamine-HCl, 1 ml de 1/10 d'une solution diluée d'oligo-éléments (6 g / L de sulfate ferreux, 0,27 g / l de molybdène, le trioxyde; 8,45 g / l d'acide borique, 5 g / L hommesulfate manganèse; 5 g / L de sulfate de cuivre; 2,27 g / l de sulfate de zinc), composé de 1 L avec de l'eau déminéralisée; et 20 g d'agar-agar; pH 5,5. A partir de la pré-culture fongique, ensemencer une nouvelle plaque de gélose recouverte de la membrane de cellophane EDTA prétraitées contenant un milieu gélose à faible teneur en carbone pour favoriser l'expansion radiale des colonies. Inoculer la boîte de Petri, gratter doucement la zone externe (où les cellules ont le même état physiologique) d'une colonie fongique de la pré-culture avec un scalpel et transférer les hyphes à la nouvelle plaque de gélose. Incuber à la température optimale de croissance jusqu'à ce que les nouvelles colonies sont d'environ 1 cm de diamètre. Pour L. bicolor S238N, incuber à 25 ° C pendant 5 jours sur un milieu de gélose P20 (0,25 g diNH 4 tartrate, 0,5 g de KH 2 PO 4, 0,25 g de MgSO 4 7H 2 O; 1 g de glucose D + , 0,5 ml de 10% de thiamine-HCl, 0,5 ml de solution d'oligo-éléments 1/10 dilué (cf. point 1.1.2.1) composé de 1 L avec de l'eau déminéralisée; et 20 g d'agar-agar; pH 5,5). Remarque: En raison de la pré-culture sur la cellophane, la deuxième culture ne contiendra pas les médias d'agar dans les bouchons centraux. Les bouchons d'agar doivent être enlevés pour une analyse ultérieure des biofilms, puisque ces bouchons introduisent agar et de nutriments qui peuvent créer des distorsions dans l'analyse. Cette étape ne concerne que les espèces fongiques qui sont conservées et propagées sur des plaques d'agar-agar, et il est pas nécessaire pour les champignons qui se propagent à partir de spores ou de stocks congelés. Préparation des cultures bactériennes Utiliser une boucle stérile pour recueillir deux à trois colonies bactériennes individuelles à partir d'une culture sur le milieu gélosé approprié et inoculer 25 ml de liquide de Luria-Bertani (LB) (ou tout autre moyen approprié, en fonction de la souche utilisée). Pour P. fluorescens BBc6, incuber une culture de nuit à 28 ° C avec agitation douce (~ 150 rpm). Remarque: L'utilisation d'une souchemarqués avec une protéine fluorescente, telle que la GFP, est préférable car cela permet d'éviter la réalisation d'une double coloration (bactéries et champignons) avant observation microscopique. Le moment choisi, la vitesse d'agitation et la température de l'incubation dépendent de la souche utilisée, le but étant d'obtenir une culture à croissance exponentielle tardive. 2. Préparation de la N In Vitro biofilm de bactéries sur la colonie Fungal Centrifuger la culture bactérienne à 5000 g pendant 3 min et suspension le culot dans 25 ml de tampon stérile de potassium 0,1 M de phosphate (25 g / l de KH 2 PO 4 et 2,78 g / LK 2 HPO 4, à pH 5,8). Répéter cette étape une fois et ajuster la concentration bactérienne finale à 10 9 cellules / ml avec le même tampon. Remplir une microplaque à 6 puits avec 5 ml de la suspension bactérienne (ou 0,1 M de tampon phosphate de potassium stérile pour le témoin négatif). Couper la membrane de cellophane du fungla culture al avec une lame de rasoir stérile pour obtenir des carrés de cellophane avec une seule colonie fongique sur chaque membrane. Retirez délicatement les carrés de cellophane contenant des hyphes du milieu solide en utilisant des pinces et transférer le carré de cellophane contenant des hyphes à un puits de la microplaque contenant la suspension bactérienne. Secouer doucement la microplaque, tandis que les colonies fongiques sont encore attachés à la cellophane; puis retirez les feuilles de cellophane, laissant les colonies de champignons dans la plaque. Faire incuber la microplaque avec une légère agitation (~ 60 tours par minute) à une température adaptée aux micro-organismes étudiés. Remarque: Le temps d'incubation dépend de la vitesse d'établissement du biofilm et la phase à analyser. Pour P. fluorescens BBc6 / L. bicolor, incuber à 20 ° C pendant 30 min pour obtenir biofilms stade précoce et jusqu'à 16 heures pour obtenir la maturité biofilms. 3. confocal à balayage laser Microscopie Analyse du biofilm Formation La préparation des échantillons Pour éliminer les bactéries et les bactéries planctoniques électrostatiquement attachées au hyphes, rincer le champignon en le transférant à une nouvelle microplaque 6 puits rempli de 5 ml d'une solution de sel solide (NaCl, 17 g / L) 17; agiter doucement pendant 1 min. Transférer le champignon à une nouvelle microplaque 6 puits contenant 5 ml de tampon phosphate de potassium 0,1 M stérile, agiter doucement pendant 2 minutes, et transférer le champignon à un tampon de phosphate de potassium frais. Couper la partie de la colonie fongique à imager avec un scalpel tout en le gardant dans le tampon de phosphate de potassium, de telle sorte que la section obtenue contient environ la moitié de la colonie fongique. Pour colorer l'échantillon, le transférer à une boîte de Pétri remplie d'eau stérile contenant un colorant fluorescent approprié (en fonction du but de l'analyse), et incuber dans l'obscurité. Pour visualiser le réseau fongique, d'utiliser, par exemple, le rouge Congo (0,1% Co finalencentration, 5 min d'incubation), le germe de blé agglutin (WGA) lectine conjuguée à Alexa Fluor 633 (10 pg / ml de concentration finale, 10 minutes d'incubation) ou FUN1 (10 uM de concentration finale, 10 minutes d'incubation). Si vous utilisez une bactérie non-fluorescent marqué, de contraste les cellules bactériennes avec une sonde fluorescente spécifique de l'ADN parmi les nombreux colorants d'ADN cellulaires infiltrant disponibles dans le commerce. Par exemple, utiliser DAPI (0,25 pg / ml concentration finale, 10 min d'incubation). Pour visualiser les protéines de la matrice, en utilisant une tache de protéine 21. Après coloration, rincer l'échantillon en le transférant à un couvercle de boîte de Pétri contenant 10 ml de phosphate de potassium 0,1 M stérile et agiter doucement pendant 1 min. La moitié plonger une lame dans le plat couvercle Petri et délicatement amener la section de coupe pour flotter au-dessus de la diapositive. Ensuite, retirez lentement la lame de la solution tampon, permettant à l'échantillon de régler doucement sur la diapositive. <br /> Note: Pour cette étape, il est très important de procéder avec précaution pour éviter les perturbations biofilm. Enfin, ajouter 10 ul d'anti-fading milieu de montage à l'échantillon et le couvrir avec une lamelle de verre. Remarque: Une fois que le coulisseau est disposé, l'analyse microscopique doit être effectuée aussi rapidement que possible (dans un délai maximum de 30 min) pour éviter la modification de la structure du biofilm. L' analyse au microscope confocal Examiner les lames sous un microscope laser confocal avec un objectif 10X ou 40X couplé à un logiciel d'imagerie. Note: Ici, un multi-faisceau microscope confocal à balayage équipé de 405, 488 et 561 nm lasers d'excitation, un détecteur Gaasp PMT et 10X 0,3 NA et 40X 1.2 Objectifs NA a été utilisé. Réaliser une imagerie en utilisant les paramètres adaptés au type des données demandées et aux contraintes de temps. Utilisez laser des longueurs d'onde d'excitation / émission en fonction de la tache utilisée et aux fabricants du chef vous recommandeons. Utilisez une combinaison de balayage de la tuile et les fonctions Z-stack pour obtenir des vues globales 3D de la colonie fongique et les biofilms. Remarque: Les images sur la figure 3 ont été acquises en utilisant les paramètres suivants: 8 bits / pixel, en moyenne = 2, pixel séjour = 1,58 microsecondes, carreaux scan d'images 5×5 avec coutures en ligne (10% de couverture, seuil = 0,7); Z-step = 2 pm. Pour la visualisation de données 3D, utiliser l'un des nombreux logiciels libres ou commerciaux (ceux-ci offrent de nombreuses options pour le rendu 3D). Par exemple, pour afficher les données Z-stack que 2D projections d'intensité maximale, soustrayez le canal champ lumineux, régler la luminosité et le contraste, et de fusionner les canaux pour créer une image composite. Si elles sont présentes, d'éliminer les tranches sans signal aux extrémités Z-stack. Ensuite, effectuez une projection maximale d'intensité 2D et convertir le résultat en couleur RVB. Utilisez la fonction "projet Z" dans le logiciel ImageJ 22 pour obtenir les images pressentie ici par 2D projections d'intensité maximale. 4. Analyse de la microscopie électronique Préparer les échantillons tels que décrits pour MCCL, à l'exception de l'étape 3.1.2, transférer les biofilms à l'eau stérile, au lieu d'un tampon de phosphate de potassium, après les étapes de rinçage. Ceci permet d'éviter la formation de cristaux de sel au cours de l'étape de déshydratation, ce qui perturberait l'imagerie SEM. Transférer les biofilms à un porte-échantillon et enlever l'excès d'eau; ne permettent qu'une petite pellicule d'eau pour couvrir l'échantillon. Transférer l'échantillon dans la chambre d'un microscope électronique à balayage à pression variable (VP-SEM); congeler à -50 ° C sur une scène de refroidissement Peltier; et lui permettre de geler sec lentement, directement dans la chambre SEM, avec 100 Pa de pression variable fixé pour 15 heures. Après achèvement de la lyophilisation, récupérer l'échantillon et le transférer dans un système de dépôt de film sous vide poussé. Manteau de l'échantillon avec 2 nm de platinum (mesure de quartz) sous argon plasma (2,5 x 10 -2 mbar, 35 mA). Observer l'échantillon revêtu d'un SEM équipé d'un canon à émission de champ (FEG) en utilisant la haute résolution "dans l'objectif« détecteur et une haute tension électronique de 1 kV.

Representative Results

La procédure schématique générale de la culture fongique et la préparation de biofilm sont donnés à la figure 1. La méthode de culture nous a permis d'obtenir des colonies fongiques 20 à 50 um d' épaisseur contenant quelques couches de hyphes, permettant des micro et méso-échelle des analyses du biofilm vivant hydraté en utilisant MCCL. L'application de la méthode a permis l'acquisition d'images de haute qualité de P. fluorescens biofilms BBc6 sur L. bicolor hyphes le long de la formation des biofilms (figures 2 – 4). L'analyse méso-échelle des biofilms a démontré la distribution hétérogène du biofilm de P. fluorescens BBc6 sur les hyphes de L. bicolor S238N (figures 2 et 3). Analyse méso-échelle a également permis de faire le suivi de la formation du biofilm au fil du temps (Figure3) à partir des premières étapes, dans lesquelles seules certaines bactéries ont été attachées à des hyphes (figure 3a), à la formation d'une épaisse biofilm mature (figure 3b). La haute résolution des images méso-échelle nous a permis d'effectuer des analyses micro-échelle sur les mêmes images pour obtenir les architectures de colonies (Figure 3c – d). L'analyse micro-échelle combinée avec l'étiquetage spécifique nous a permis d'aller plus loin dans la caractérisation du biofilm. Ici, SYPRO Ruby 23, qui marque la plupart des classes de protéines, a été appliquée aux échantillons (figure 4) et montre la présence de protéines dans la matrice. Enfin, d' autres détails de la structure du biofilm ont été obtenues par SEM imagerie du même échantillon après déshydratation et le revêtement (Figure 5). imagerie SEM fournil'accès à l'échelle nanométrique, donnant ainsi accès à la structure de la matrice. Figure 1: Procédure schématique globale de la culture fongique et la préparation de biofilm. Cette figure décrit les principales étapes du procédé, à partir de cultures de micro-organismes à l'échantillon des analyses. Plus de détails sont donnés dans le protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: BBc6 biofilm sur la répartition colonie fongique. L'échantillon a été imagée après 18 h d'interaction à un grossissement de 10X. L'image a été obtenue par projection 2D d'intensité maximale des images 3D de microscopie confocale. La grille grise sur la figure représente les positions de mosaïque. L. bicolor hyphes sont colorées avec le Congo Red (rouge) et les bactéries sont GFP-marqués (vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3: stades précoces et tardifs de BBc6 formation de biofilm sur L. bicolor hyphes. Cette image a été obtenue par projection 2D d'intensité maximale des images 3D de microscopie confocale. L'imagerie a été réalisée à un grossissement de 40X. (A) biofilms répartition après 2 h d'interaction. (B) biofilm répartition après 14 h d'interaction. (C) l' élargissement du rectangle blanc (a). (D) L' élargissement du rectangle blanc (b). hyphes sont colorées avec le Congo Red (rouge) et les bactéries sont GFP-tagged (vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4: Matrice coloration des BBc6 biofilm sur L. bicolor hyphes. (A) biofilms après 16 heures d'interaction. (B) L' élargissement du rectangle blanc (a). L'imagerie a été réalisée à un grossissement de 40X, et ces images ont été obtenues par l'intermédiaire 2D projection d'intensité maximale des images 3D de microscopie confocale. Les bactéries sont GFP-marqués (vert), champignon est coloré avec Fun1 (vert foncé), et les protéines sont colorées avec S. Ruby (rouge). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <p class= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figure 5: SEM imagerie de biofilms BBc6 sur L. bicolor hyphes. SEM Imaging a été réalisée à 2360X, EHT: 1kV. Avant l'imagerie, l'échantillon a été lentement lyophilisé dans la chambre SEM et revêtu de platine. Les flèches vertes indiquent les biofilms bactériens et les flèches jaunes indiquent hyphes fongiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les biofilms bactériens sont récupérés dans de nombreux environnements et ont été étudiés depuis les années 1950, conduisant à l'élaboration d'un certain nombre de méthodes pour les 24 analyser. Les méthodes classiques pour quantifier et biofilms surveiller comprennent des essais de micro-titrage et, la méthode la plus largement utilisée, cristal violet (CV) coloration. Ces méthodes sont rapides, à faible coût, et facile à manipuler 25 et sont particulièrement utiles pour quantifier la biomasse biofilm totale ou pour effectuer la viabilité et de la matrice de quantification des essais. Sur un autre côté, les méthodes «omiques» sont également utiles dans des études de biofilm, ce qui permet des analyses quantitatives et fonctionnelles des biofilms 26, 27. Malgré les avantages de la plaque micro-titre et «omiques» méthodes, plusieurs caractéristiques essentielles de biofilms ne peuvent pas être capturées avec ces techniques, ce qui entrave une compréhension complète de ce processus. Ces caractéristiques comprennent la structure matricielles, architectures de colonies bactériennes, des interactions cellule / cellule, et les modèles de colonisation, qui sont des données clés pour comprendre à la fois le fonctionnement des biofilms et la dynamique de leur formation. Malgré la capacité de la microscopie pour capturer ces caractéristiques, l'analyse microscopique des biofilms bactériens sur les champignons filamenteux sont encore rares. Ceci est principalement dû à la croissance des champignons filamenteux, qui forme souvent des colonies de réseaux tridimensionnels épaisses, complexes. La formation de biofilms bactériens sur les champignons est commun dans des environnements divers et est impliqué de façon significative dans les différents domaines 4 (par exemple, la médecine, l' agriculture et l' environnement.); par conséquent, il est essentiel de développer de nouvelles méthodes pour faciliter leur enquête. À cette fin, nous avons combiné une méthode pour générer très minces colonies fongiques avec l'imagerie microscopique des biofilms bactériens. En outre, nous avons proposé un ensemble d'outils de microscopie pour analyser qualitativement ces biofilms. Le succès du procédé se fonde surla capacité de produire très minces colonies de hyphes et d'appliquer les colorants appropriés. Ces points sont discutés ci-dessous.

En raison des structures complexes des biofilms, la compréhension de leur fonction nécessite une approche multi-échelle 28, 29. Les modèles de distribution des biofilms, architecture bactérienne de la colonie, et la structure de la matrice et la composition sont analysés à différentes échelles (ie, méso-échelle et micro-échelle). En outre, la résolution à l'échelle nanométrique permet d'accéder aux interactions physiques cellule / cellule et de la nano-structure de la matrice. Ainsi, la méthode développée permet facilement une analyse multi-échelle des biofilms bactériens formés sur la colonie fongique.

Dans la plupart des études, MCCL analyse des biofilms sont limitées à la micro-échelle, le méso-échelle étant habituellement réalisée par tomographie par cohérence optique 30, 31, <supclass = "xref"> 32. La méthode présentée ici permet à la fois des analyses micro et méso-échelle par MCCL. Il démontre l'utilité de combiner les deux analyses dans la même région de l'échantillon et même sur la même image à l' aide de la nouvelle génération de microscopes confocale à haute résolution (Figure 3). Ainsi, les questions liées aux données compilées sont réunis à différentes échelles avec des méthodes différentes sont ici évités.

Cette combinaison d'analyses a permis d'accéder à la répartition de façon concomitante d'un biofilm sur la colonie fongique, l'architecture de la colonie bactérienne long du biofilm de développement, et la structure de matrice. L'analyse méso-échelle a montré une distribution hétérogène des biofilms bactériens sur les colonies fongiques (figures 2 et 3). Cette observation aurait pas été possible avec les protocoles qui ne permettent que l'imagerie d'une petite partie de la colonie fongique, qui ne sont pas nécessairement représentatifs de toute la colonie. Ainsi, alors quesouvent négligé, l'analyse méso-échelle peut donner de précieuses informations sur les modes de distribution de biofilm.

Enfin, le procédé mis au point peut être utilisé pour analyser des échantillons avec différentes techniques de microscopie, notamment la microscopie électronique à balayage. Ici, SEM a été utilisé pour atteindre l'échelle nanométrique et d'obtenir l'organisation spatiale bactérienne au sein du biofilm. Il a très bien performé avec les colonies minces fongiques, tandis que SEM seulement permis l'imagerie de surface. Contrairement à MCCL, SEM, cependant, exige une déshydratation de l'échantillon et, le plus souvent, le revêtement d'un métal conducteur. Ce processus de déshydratation peut modifier les structures biologiques quand il est pas correctement exécuté et peut nécessiter l'optimisation. Ici, la déshydratation de l' échantillon en utilisant la lyophilisation lente a été utilisé 33. Néanmoins, l'application à la fois MCCL et SEM pour les échantillons permettra à la performance de microscopie corrélative à la même position de l'échantillon.

En dépit des avantagesdécrit ci-dessus, certaines limitations existent. Tout d'abord, il peut ne pas être applicable à tous les types de champignons. En effet, cette méthode de culture a été développée pour les champignons étalement radialement sur la surface du support solide. Cette méthode peut ne pas être approprié pour les champignons formant des hyphes principalement aérienne (par exemple, Fusarium sp.) Ou pour les micro-aérobie champignons épandage principalement à l' intérieur agar. De plus, les champignons dégradant cellophane peut être problématique aussi bien (par exemple., Trichoderma sp.). En second lieu, il est important de noter que la stratégie de marquage est un point critique et le choix de la tache doit être faite avec soin, car la tache ne doit pas perturber le biofilm. Par exemple, nous avons remarqué que calcofluor blanc a entraîné des perturbations de biofilm partielle (données non présentées), probablement en raison du pH élevé de cette tache. En outre, certains colorants produits de coloration hétérogène (par exemple., Rouge Congo), tandis que d' autres produits de coloration homogène (par exemple., La paroi cellulaire coloration avec la lectine WGA), ce qui donne une qualité d'image hétérogène.En outre, il est important d'être conscient que certains colorants pourraient ne pas être entièrement spécifique. Par exemple, les taches WGA non seulement les parois des cellules fongiques , mais aussi de l' acide N-acétylneuraminique dans les parois cellulaires des bactéries Gram-positives et des adhésines produites par des bactéries Gram-positives que négatives lors de la formation d' un biofilm 34, 35. Par conséquent, en utilisant des bactéries de protéines étiquetées fluorescentes et / ou des champignons est recommandée pour éviter les taches multiples. Si plusieurs colorants sont utilisés, ils ne doivent pas interférer chimiquement, et leurs spectres d'émission ne doivent pas se chevaucher.

analyse méso-échelle nécessitent une grande surface balayée, et donc, MCCL peut prendre du temps (40 min à 1 h, en fonction de l'épaisseur de l'échantillon) et goulot d'étranglement de l'analyse d'un grand nombre d'échantillons. Néanmoins, des ajustements peuvent être effectués en fonction du type de données requises. Il est possible de réduire le temps d'acquisition et la taille de l'image en modifiant la qualité de l'image. Par exemple, en haute résolutionest pas nécessaire d'analyser le biofilm répartition générale.

Enfin, certaines limitations doivent être pris en compte lors du choix d'afficher les données de la pile Z- que des projections 2D ou 3D. projections à deux dimensions sont une bonne façon de résumer les données, mais des informations de profondeur sont perdues, et les structures qui se chevauchent deviennent cachés. D'autre part, les projections 3D permettent la visualisation de différents points de vue, mais ils rendent souvent mal en cas de complexité spatiale.

En conclusion, nous avons rapporté une méthode pour la caractérisation des biofilms bactériens sur hyphes au niveau structurel. La méthodologie peut être étendue à d'autres applications. En effet, cette méthode permet l'exécution de la caractérisation fonctionnelle ou chimique des biofilms bactériens qui se forment sur les hyphes fongiques. En raison de la grande variété de systèmes fluorescents existants rapporteurs, l' analyse de MCCL peut être utilisé à des fins multiples 29. Par exemple, le micro de fluorescenceroscopie peut être utilisé pour surveiller un gradient de pH 36 ou par diffusion dans les films biologiques 37 molécule. En outre, la méthode permet une analyse de la communauté dans les biofilms multispécifiques. Par exemple, hybridation in situ fluorescente ciblant des groupes bactériens spécifiques est particulièrement utile pour étudier la répartition bactérienne spécifique dans multispécifique biofilms 38, 39. Derniers, de nombreux colorants fluorescents peuvent être utilisés pour caractériser la composition de matrice de 21 biofilms. Ici, les protéines ont été ciblées à l' aide Sypro qui colore une large gamme de protéines, dont des protéines de la matrice (figure 4), mais d' autres colorants permettent la visualisation des autres constituants de la matrice importantes, telles que des exopolysaccharides ou de l' ADN extracellulaire. Fait intéressant, toutes ces analyses peuvent être effectuées à l'échelle méso en utilisant la méthode décrite. Etant donné que MCCL peut être réalisée sur des échantillons biologiques,il est également possible de réaliser l'imagerie time-lapse en utilisant, par exemple, des chambres, particulièrement adaptée à fines coverwell colonies de champignons. Cette option est particulièrement intéressante, car la formation de biofilm est un processus dynamique complexe. Enfin, dans un but quantitatif, le procédé décrit peut améliorer la précision de l'analyse quantitative automatique en faisant cette quantification possible sur les images méso-échelle. Cela peut surmonter biofilm hétérogénéité et les questions statistiques 29.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the French National Research Agency through the Laboratory of Excellence ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), the Plant-Microbe Interfaces Scientific Focus Area in the Genomic Science Program, and the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. Oak Ridge National Laboratory is managed by UT-Battelle, LLC, for the United States Department of Energy under contract DE-AC05-00OR22725.

Materials

6 well Falcon Tissue Culture Plates Fisher Scientific 08-772-33 Used in 2.2 & 3.1
Congo Red Fisher Scientific C580-25 Used in 3.1.4.1
FUN 1 Cell Stain Thermo Fisher Scientific F7030 Used in 3.1.4.1
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate Thermo Fisher Scientific W21404 Used in 3.1.4.1
DAPI solution Thermo Fisher Scientific 62248 Used in 3.1.4.2
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 Used in 3.1.4.3
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain Thermo Fisher Scientific F10318 Used in 3.1.4.4
Fluoromount-G Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01 Used in 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1 Zeiss Used in 3.2.1
ZEN 2.1 lite black software  Zeiss Used in 3.2.1
High Vacuum Coater Leica EM ACE600 Leica Used in 4
GeminiSEM-FEG Zeiss Used in 4
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Miquel Guennoc, C., Rose, C., Guinnet, F., Miquel, I., Labbé, J., Deveau, A. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e54771, doi:10.3791/54771 (2017).
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