이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법
Summary
A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.
Abstract
This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized ‘lysine’ and guanido functionalized ‘arginine’ peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.
Introduction
펩 토이 드 (또는 폴리 N은 글리신 – 치환) 펩티드 유사한 특성을 제공하며, 같은 점점 더 의약 및 재료 응용 프로그램에 대한 연구되고있다 펩타이드 모방 체의 클래스입니다. 펩티드에서 각 아미노산의 측쇄는 아미드 주쇄의 α 탄소에 연결되고; 펩 토이 드의 측쇄가 주쇄의 질소 원자에 시프트된다. 결정적으로,이 펩 토이 드에게 단백질 분해에 더 큰 저항을 제공합니다.
펩 토이 드 일반적으로 1이다. Zuckermann 외., 펩 토이 드 단량체 고체 지지체 및 일차 아민을 사용하여 할로겐 후속 변위에 부착 된 아민 관능기 순차적 haloacetylation에 의해 만들어 질 수 의해 개척 submonomer 방법을 사용하여 합성된다 우리 그룹은 최근 개발 이 submonomer 방법에 대한 적응은 라이신과 아르기닌 형 펩 토이 드 잔류 물은 F에 대해 동일한 펩 토이 드 순서에 포함 할 수 있도록하는IRST 시간.이 합성 펩 토이 드하는이 매뉴얼 고상 방법은 실험실의 대부분이 접근 할 수 있도록 시판 시약 및 일반적인 실험실 장비를 사용합니다. 펩 토이 드 그람 음성균, 알려진 많은 항균 펩타이드에 필적 그람 양성 세균 및 진균 종의 넓은 범위에 대해 유망한 활동을하는 것으로 나타났다. 3-9
우리의 연구에서 펩 토이 드는 소외 열대 질환 슈만 편모충 증의 치료를위한 새로운 항 감염 화합물로 사용되어왔다. 5, 10 리 슈만 편모충 증은 전 세계적으로 80 개국 이상에서 발병이며이 만 12 명 이상이 전 세계적으로 감염되는 것으로 추정된다. 11를 질병은 샌드 플라이의 입에 의해 전송되는 원생 동물 기생충에 의해 발생합니다. 슈만 편모충 종은 피부 리 슈만 편모충 증, 점막에 흉터 및 손상에 이르게하는 조건, 또는 생명을 위협하는 내장 휴식을 일으킬 수 있습니다치명적인 장기 손상의 원인 hmaniasis. 백신이 질병중인없고 기존의 치료는 심각한 부작용을 약물의 적은 수에 의존한다. 또한, 기존의 약제에 대한 내성 때문에 새로운 치료법이 절실히 효과적으로 앞으로 슈만 편모충 증을 치료하기 위해 필요한 신흥 심각한 문제이다. 12-16
이러한 항균 애플리케이션에서, 펩 토이 드 종종 양이온 및 소수성 단량체의 혼합물 매성되도록 설계된다. 3,4- 이것은, 펩 토이 드를 균체 향해 선택성의 정도를 제공 포유류 세포에 독성을 감소시키고, 분자 수송 체로서의 활성을 향상시킬 수있다 . 17-20 문헌 항 감염성 펩 토이 드의 대부분 배타적 아미노 관능 리신 형 모노머 또는 아르기닌 잔기 형 어느 구성되는 양이온 성 측쇄를 함유한다. 양이온 체인이 ㄱ 구성되어 펩타이드 펩 토이 드의 키메라,미노 아미노산 리신 또는 아르기닌은 또한 활성 및 독성에있어서, 양이온 성 기의 효과를 조사하기 위해 합성되었다. 21-25
폴리 리신 펩 토이 드 용이 시판 BOC 보호 된 아민을 이용하여 합성 할 수있다. 폴리 아르기닌 펩 토이 드는 guanidinylation 제로서 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘을 사용하는 방법을 사용하여 제조 될 수보고. 펩 토이 제거 측쇄상의 수지 및 BOC 보호로부터 절단 된 후 18하지만, 이것은 단지 따라서 수행 될 수있다 시퀀스 내의 모든 리신 형 잔기가 아르기닌 잔기로 전환된다. 미세 조정하기위한 노력으로 화합물의 화학적 및 생물학적 특성은, 우리는 (예를 들어, N리스 및 N의 Arg)이 처음으로 임의의 주어진 펩 토이 드 시퀀스에 포함되는 이중 양이온 성 기능성을 허용하는 방법을 개발 하였다. (2)
여기서, 우리는 TW의 합성, 정제 및 특성을 설명동일한 순서로 모두 라이신과 아르기닌 형 잔류 물을 포함하는 새로운 펩 토이 드 오. 이 방법은 guanidinylation 시약과 같은 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘으로 수지에 직교하는 N과 N -Boc -Dde 보호를 이용한다. 이러한 펩 토이 드의 생물학적 평가도 슈만 편모충 멕시 카나, 피부 리 슈만 편모충 증의 원인균에 대한 세포 독성 분석에서 설명된다. 이러한 이중 기능성 양이온 펩 토이 드에 액세스하고 자신의 생물학적 활성을 평가하기위한 실용적인 방법을 제공한다. 또한이 방법은 앞으로 펩 토이 커뮤니티 매성 펩 토이 드의 합성을 돕는 것으로 예상된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
펩 토이 드는 점점 신규 치료제 3-5 세포 전달 제로서 애플리케이션의 화학 생물학 및 의약 화학 분야에서 연구되고있다 (18, 20)과 진단 툴. (29)은 일반적으로,이 서열은 위에 병원체에 대한 선택성의 정도를 제공하는 양이온이다 포유 동물 세포의 세포막을 관통하며, 수성 시스템에서의 용해도를 원조 할 수있는 능력. 문헌에서 단독으로 라이신 또는 아르기닌 모방 잔류 물을 포함하는 양이온 펩 토이 드의 수많은 사례가있다. 그러나, 지금까지 동일한 순서로 이들 양이온 성 잔기를 모두 포함 펩 토이 드의 합성은 적합한 합성 방법의 부족에 의해 방해되어왔다. 여기에 설명 된 프로토콜을 혼합 양이온 펩 토이 드 효율적인 방식으로 합성 할 수 있으며이 양친 매성 펩 토이 드의 생물학적 및 화학적 성질을 조절하는 경로를 제공로서 매우 바람직하다.
NT는 "> 우리의 방법은 일반적으로 사용 submonomer의 펩 토이 드 합성 적응을 사용하며, 동일한 시퀀스 내에서 모두 라이신과 아르기닌 – 타입 단량체의 첨가를 허용한다. 실온 커플 링을 사용하며이 방법 것으로 예상되도록 그룹 화학 보호 설립 연구 그룹의 대부분에 유용 할 것이다. 아르기닌 형 잉위한 직교 보호를 추가하려면 보호 디아민 DDE-OH. 디아민 다양한 될 수로 60 분 커플 표준 용량 조건하에 첨가하고 보호 각각 1,6- 디아 미노 헥산에 1,2- 디아 미노가. 보호기 DDE-OH는 DMF에 잘 용해 즉, 설치하는 긴 2 탄소 6 개의 탄소에서 사이드 체인을 허용하고 매우 효율적이고 선택적 보호 그룹 인 사용 주 아민은. DDE를 보호 그룹은 영향을받지 예를 들어, 펩 토이 드 체인의 보호되지 않은 N 말단을 2 급 아민을 떠난다. 30 한 제한이있는가 SYN의 모든논문 수동으로 수행되었다; 그러나, 개발 커플 링 조건 자동화 펩티드 / 합성 펩 토이 드와 함께 사용하기위한 방법은 의무 할 것으로 예상된다.DDE를 집단의 수지에 탈 보호 된 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘을 사용하여 수지에 guanidinylated 수 유리 아민을 떠나야 DMF 2 % 히드라진 용액을 사용하여 수행된다. 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘 여섯 당량 및 DIPEA 여섯 등가물 수지에 유리 아민 당 사용된다 (즉, 각 N의 Arg 계 단량체 여섯 당량이 설치된다). 또,이 반응은 효율적이며 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘 시약 DMF에서 우수한 용해도를 갖는다. 반응 완료는 전형적으로 실온에서 60 분, LC-MS를 통해 알 수있다.
submonomer 방법의 다양성에 일차 아민의 다양한이 치환 공정에서 사용할 수있는 조건으로 인해 결합 effi을 높이기 위해 최적화 될 필요가있을 수 있으므로위에서 설명한 순서에 대한 ciency 및 전체 제품 수율 또는 순도. (31)는, 특별한 조건이 성공적으로 커플 링 필요 없었다. 그러나 더 이상 변위 시간 이상 아민 농도는 문제가 변위 (즉, 잘못 친 핵성 또는 입체적으로 부피가 큰 아민의 경우)에 사용될 수 있습니다. 일부 아민이 경우 대신 submonomer 합성 이전 광범위한 방법과 같이 N 메틸 -2- 피 롤리 돈 (NMP) 또는 고상 반응을위한 다른 적절한 용제에 이들을 용해 권장 DMF에 완전히 용해하지 않을 펩 토이 드들. 32 클로로 아세트산을 사용하여 아세틸 화는 다른 그룹에 의해 효과적인 것으로 밝혀졌다, 측쇄에서 보호되지 않은 헤테로 원자를 함유 단량체를 포함한다.도 33은 또한 다른 수지 다른 C 단자 작용과 펩 토이 드를 수득하기 위해이 방법을 이용할 수있다. 왕 수지 및 2- 클로로 트리 클로라이드 수지는 일상적으로 사용펩 토이 드의 submonomer 합성. 예를 들어,이 방법은 성공적으로 스케이트장 아마이드 여기 (사용 된 특정 수지에 따라 다름) 논의에 2 다른 고체 지지체가 다른 넣기 절차가 필요합니다. 우리 그룹 2 – 클로로 트리 클로라이드 수지로 사용되어왔다 그래서 이것은 문헌으로 확인해야 합성하기 전에.
펩티드 합성 마찬가지로, 펩 토이 드 오프 수지의 최종 분해의 조건은 특정 서열에 대해 최적화 될 수있다. 이 프로토콜에서, TFA 절단 칵테일 (청소부와 같은 트리 이소 프로필 실란 및 물)를 사용 하였다. 여기에 제시된 펩 토이 드는 합리적으로 산 불안정 그룹에만 BOC 보호가 포함되어 있습니다. 이상 절단 시간 필요할 수 보호 잔기 또는 불안정한 보호기 적은 산의 큰 비율이 서열의 완전한 탈 보호를 보장하기 위해 (즉, 2 시간 초과 분해 시간은 PBF 또는 고등 BU를 포함하는 서열을 권장TYL 에스테르 보호 그룹). (예를 들어, 에탄 디티 올, 2- 메르 캅토 에탄올 종종 시스테인 또는 메티오닌과 같은 황 함유 측쇄를 가질 펩티드의 사용을 위해) 대안 거제는 전문 측쇄에 사용될 수있다.
제시된 생물학적 분석은 상이한 세포주에 맞게 변경 될 수있는 표준 독성 시험이다. 각 96 웰 플레이트를 얻은 결과의 신뢰도를 허용하기에 충분한 제어를 포함한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 이 병을 치료하기 위해 사용되는 공지 약물이기 때문에,이 경우, 암포 테리 신 B는 양성 대조군으로 사용되며, 이는 분석을 위해 화합물 축적량을 확인하는 데 사용되는 용매가 그대로 DMSO가 음성 대조군으로서 사용된다. 다른 세포주가 사용되는 경우, 다른 적합한 제어 수득 및 사용하기 전에 확인한다. L. 멕시 1 시간 (100) 및 2 μM의 농도 사이에서 펩 토이 드와 함께 배양되고, 그 후 기생충 / 펩 토이 드 용액으로 희석(즉, 우물이 처음에 100 μM 펩 토이 드 재고 10 μM로 희석) 하룻밤 배양을위한 10 배.
세포 생존율 시약은 분석의 단부에 각 웰 (총 웰 용적의 10 %)에 첨가된다. 가시 색상 변경없이 실행 가능한 기생충 (파란색)과 가능한 기생충의 중간 숫자 사이의 스펙트럼 가능한 기생충 (핑크), 제어 우물과 우물 사이에 볼 수있다. 형광은 살아있는 세포의 수에 비례하여 세포의 대사 활동에 대응하고; 레사 주린 염료 (비 형광) 대사 적 활성 세포의 환원 반응에 의해 형광 레조 루핀 (resorufin)로 변환된다. (34)이 분석에서, 세포 생존 시약 배양 시간은 L. 최적화되었습니다 멕시 카나. 플레이트 달라질 가능성 시약 배양 시간은 다른 세포 농도 또는이 방법을 사용할 수도있다, 예를 들어 상이한 세포주 (시드) 포유 동물 세포와. 사용되는 정확한 플레이트 판독기에 의존는 고려 형광 측정을 수행하기 전에 이루어질 필요가있다. 웰 기포 정확한 측정이 수행 될 수 있도록하기 위해 제거되어야한다. 일부 플레이트 리더는 경우 평면 사용되어야한다 96 웰 플레이트를 바닥있는 판의 바닥에서 읽습니다. 다른 컴퓨터는 판의 상부로부터 판독 할 수 있으므로 플레이트의 뚜껑을 측정하기 전에 제거되어야한다.
마지막으로, 앞으로,이 프로토콜은 동시에 여러 서열을 제조 할 수있는 자동화 된 합성기와 호환 될 수있다. 또한, 환상 펩 토이 드의 합성은이 방법을 사용하는 것도 가능하다. 이 프로토콜은 물질 또는 의약 분야를 포함한 다양한 애플리케이션에 이용 될 수도있다 라이신과 아르기닌 형 단량체 모두 신규 한 펩 토이 드 골격에 액세스하는 데 사용할 수있는 실용적인 합성 절차 연구를 제공한다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 금융 지원을위한 공학 및 물리 과학 연구위원회 (EPSRC) (HLB)을 감사드립니다. 우리는 또한이 절차의 촬영 동안 그녀의 도움 스리 데비 Maalika Ramanoudjame 감사합니다.
Materials
| Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits | Crawford Scientific | 12131017 and 12131015 | 20 mL and 6 mL cartridges used in this preparation |
| Trifluoroacetic acid | Tokyo Chemical Industry (Europe) | T0431-100g | >98%; CAUTION can cause severe burns and respiratory irritation |
| N-N'-diisopropylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 38370-100ML | >98%; CAUTION hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation |
| Dimethylformamide | Fischer Scientific | 10346180 | HPLC grade; CAUTION suspected teratogen |
| Acetonitrile | Fischer Scientific | 10407440 | HPLC grade |
| Dichloromethane | Fischer Scientific | 10354263 | 99.8%; CAUTION suspected carcinogen |
| Bromacetic acid | Sigma Aldrich | 17000-100G | >99%; ; CAUTION causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract |
| (S)-(-)-alpha methylbenzylamine | Sigma Aldrich | 115568-100G | 98%; CAUTION harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer |
| N-Boc 1,4 diaminobutane | Tokyo Chemical Industry (Europe) | A1373-25g | >98%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer |
| N-Boc 1,2 diaminoethane | Tokyo Chemical Industry (Europe) | A1371-25g | >97%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer |
| 1,2 diaminobutane | Sigma Aldrich | D13208-100G | 99%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer |
| 1,4 diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550-250ML | >99.5%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer |
| 1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl | Sigma Aldrich | 402516-10G | as HCl salt; CAUTION harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage |
| Hydrazine monohydrate | Sigma Aldrich | 207942-5G | reagent grade; CAUTION suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes |
| 2-acetyl dimedone | Novabiochem | 8510150005 | Dde-OH |
| Rink Amide resin | Novabiochem | 8551190005 | 100-200 mesh, high loading |
| Piperidine | Sigma Aldrich | 411027-1L | >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects |
| Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781-50G | 98%; CAUTION flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation |
| alamarBlue | ThermoFischer | DAL1025 | Not classified as hazardous |
| Schneider's Insect Medium | Sigma Aldrich | S9895-1L | Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays |
| 96 well plates | VWR | 734-1793 | Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated |
| Solvent reservoirs | VWR | 613-1182 | Used with multi channel pipette |
| Multi channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | |
| Pipette tips | Starlab Group | S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 | Volume of tip dependent on pipette used. 10 µL, 10 – 200 µL and 1000 µL recommended for assays |
| 25 cm3 cell culture flasks | VWR | 734-2312 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 525-0791 | |
| dimethylsulphoxide (molecular biology grade) | Sigma Aldrich | D8418-50ML | Not classified as hazardous |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | ThermoFischer | 10082139-100mL | Gibco |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer | 15140148-20mL | Abbreviation: P/S |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | 46006-100mg | Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard |
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