L'utilizzo di una cartuccia filtrante per filtrazione di acqua campioni ed estrazione di DNA ambientale
Summary
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Abstract
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Introduction
DNA ambientale (Edna) in ambienti acquatici si riferisce a materiale genetico trovato nella colonna d'acqua. Recenti studi hanno dimostrato l'utilità di Edna per la rilevazione di pesci da vari ambienti acquatici, tra stagni, fiumi 1-3 4-8, torrenti 9, e l'acqua di mare 10-14. La maggior parte di questi studi si sono concentrati sulla individuazione di un unico o pochi invasivo 1,4-6,8,14 e rare o minacciate specie di 3,9, mentre alcuni studi recenti hanno tentato il rilevamento simultaneo di più specie in comunità ittiche locali 7,9, 12,13,15 e mesocosmi 11,12.
Quest'ultimo approccio è chiamato "metabarcoding" e Edna metabarcoding utilizza uno o più set di primer PCR per coamplify una regione del gene attraverso campioni tassonomicamente diversi. Questo è seguito da preparazione biblioteca indicizzazione e aggiunta adattatore, e le librerie indicizzati sono analizzate per un high-throughput sequenziamento parallelopiattaforma. Recentemente Miya et al. 12 hanno sviluppato universali primer PCR per metabarcoding Edna dai pesci (chiamati "MiFish"). I primer MiFish bersaglio una regione ipervariabile della mitocondriale 12S rRNA gene (163-185 bp), che contiene informazioni sufficienti per identificare i pesci alla famiglia tassonomica, genere e specie ad eccezione di alcuni congeneri strettamente correlati. Con l'uso di questi primer a Edna metabarcoding, Miya et al. 12 rilevati più di 230 specie marine subtropicali da acquari con noti composizione delle specie e barriere coralline vicino l'acquario.
Mentre l'ottimizzazione del protocollo metabarcoding per accogliere l'acqua di mare naturale, con livelli di concentrazione Edna dai pesci varia, abbiamo notato che i primer MiFish di tanto in tanto non è riuscito a amplificare la regione di destinazione per la successiva preparazione biblioteca. Uno dei motivi più probabili per questo l'amplificazione PCR infruttuoso è la mancanza di adeguate quantità di Template DNA contenuto in piccoli volumi di acqua filtrata (cioè 1-2 L). Anche se la concentrazione Edna da uno specifico gruppo tassonomico è inconoscibile prima l'amplificazione, la filtrazione di grandi volumi d'acqua (> 1-2 L) sarebbe un mezzo semplice ed efficace per raccogliere più Edna dagli ambienti acquatici con scarsa abbondanza di pesce e la biomassa, come ad esempio open-mare e in acque profonde ecosistemi.
Rispetto al filtri in fibra disco convenzionalmente utilizzato in un certo numero di ricerca pesci Edna 16, cartucce filtranti hanno il vantaggio di ospitare volumi idrici grandi prima intasamento 17. In realtà, un recente studio ha dimostrato grande volume (> 20 L) filtrazione di campioni di acqua di mare costiere che utilizzano cartucce filtranti 18. Inoltre, essi sono confezionati singolarmente e sterile, e diversi passaggi del flusso di lavoro sperimentale possono essere eseguite nell'alloggiamento del filtro, riducendo così la probabilità di contaminazione da laboratorio 19. L'ultimocaratteristica è fondamentale per Edna metabarcoding, in cui il rischio di contaminazione rimane tra le più grandi sfide sperimentale 20,21. Nonostante questi vantaggi tecnici di cartucce filtranti, non è stato utilizzato in studi Edna di pesci con due eccezioni 8,15.
Qui forniamo un protocollo per la filtrazione dei campioni di acqua con la cartuccia del filtro e l'estrazione di Edna dal filtro senza dover tagliare aprire l'alloggiamento. Forniamo anche due sistemi di filtrazione dell'acqua alternativi a seconda dei volumi d'acqua (≤4 L o> 4 L). Per confrontare le prestazioni del protocollo di nuova concezione e un protocollo precedentemente utilizzato utilizzando un filtro in fibra di vetro nel nostro gruppo di ricerca 12,14,22,23, eseguiamo Edna metabarcoding analisi di acqua di mare da un serbatoio acquario enorme (7.500 m 3 ) con nota composizione delle specie, e visualizza il numero di specie rilevate derivati dai due protocolli come risultati rappresentativi. Questo protocollo hcome stato sviluppato per la metabarcoding Edna dai pesci, ma è anche applicabile ad Edna da altri organismi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In molti studi metabarcoding utilizzando campioni ambientali come l'acqua e il suolo, il trattamento post-filtrazione della cartuccia filtrante è generalmente come segue 24,25: 1) taglio aperto e screpolature della custodia con utensili manuali (taglio per tubi o pinze); 2) la rimozione del filtro dalla cartuccia; e 3) taglio del filtro in piccoli pezzi con una lametta per l'estrazione del DNA. Per evitare tali diversi metodi di estrazione del DNA ingombrante e richiede tempo procedure che sono sogge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a ‘snapshot’ of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA – a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J., DeLong, E. E. . Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. 10, 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K., Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. . Molecular Microbial Ecology Manual. , 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -. C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A., Micic, M. . Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples’Springer Protocols Handbooks. , 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
