Analyse van eiwit import in chloroplasten Geïsoleerd van Stressed Planten

1. Groei van Arabidopsis planten en de stressbehandeling Bereid 1 l Murashige en Skoog (MS) medium door toevoeging van 4,3 g MS basaal zoutmengsel, 10 g sucrose, 0,5 g 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) met gedeïoniseerd water tot 1 l, en pas de pH op 5,7 met kaliumhydroxide (KOH). Voeg 6 g phytoagar en autoclaaf gedurende 20 minuten bij 120 ° C. Voordat stollen, giet het medium in round Petri platen (diameter 9 cm, hoogte 1,5 cm, met 20 – 25 ml MS-medium per plaat). Laat de platen voor ~ 1 uur in een laminaire stroming kap drogen voordat het sluiten van de deksels. Plaats Arabidopsis thaliana zaden in een 1,5 mL reageerbuis oppervlaktesterilisatie door toevoeging van 1 ml 70% (v / v) ethanol dat 0,02% (v / v) Triton X-100 en voortdurend schudden gedurende 5-10 min. Voor elk genotype / conditie, bereiden 10 Petri platen die elk ~ 100-150 zaailingen. Wacht ongeveer 10 seconden totdat de zaden af ​​te wikkelen naar debodem van de buis, en dan gooi het supernatant door pipetteren. Voeg 1 ml 100% ethanol, en schud de buis opnieuw voor 10 min. Bereid de laminaire stroming kap, terwijl de zaden zijn steriliseren. Neem een ​​stuk filterpapier per monster, vouw het in de helft van de inzaai te vergemakkelijken, en laat deze in 100% ethanol in de kap. Wacht tot het droogt volledig uit. Merk op dat 100% ethanol wordt gebruikt als het sneller dan 70% ethanol verdampt. Breng de zaden op het filterpapier door pipetteren met een 1 ml pipet tip cut ~ 5 mm van het fijne einde. Laat ze drogen, die ongeveer 10 moet nemen – 15 min. Zaai ~ 100-150 gesteriliseerde zaden gelijkmatig op elke MS-medium Petri plaat, en sluit elke plaat met chirurgische tape. Bewaar de platen ondersteboven op 4 ° C gedurende 2 – 4 d aan te moedigen en te synchroniseren kieming. Oude zaden kan nodig zijn om langer bij 4 ° C blijven (tot een week). Breng de platen om een ​​plant weefselkweek kamer en laat ze op zijn kop op.Groeien de planten gedurende 8 d onder een lange-daagse cyclus (16 h 100 umol m · – · 2 s – 1 licht, 8 uur donker) bij 20 ° C. Tegen stress behandeling, wanneer de planten zijn 8 d oud, in de stroom kap, breng ze uit het agar medium, door ze voorzichtig af te schrapen met de hand dragen-ethanol gesteriliseerde handschoenen, in een gesteriliseerde fles van vloeibaar MS medium dat de stressor (bv , 200 mM mannitol). Vermijd overdracht agar medium. Bedek de kolf mond gesteriliseerde folie en laat de planten groeien onder dezelfde omstandigheden als in stap 1,8 gedurende nog 2 d op een orbitale schudder onder zacht schudden (-100 rpm). 2. Het maken van een Precursor eiwit door in vitro transcriptie / translatie Opmerking: Dit protocol veronderstelt het gebruik van Arabidopsis fotosysteem I subeenheid D precursor (pPsaD) als de matrijs / preproteïne, maar de methode is geschikt voor anderen. <ol> Kloon de coderende sequentie (CDS) van pPsaD in de meervoudige kloneringsplaats (MCS) van het pBlueScript II SK vector (of een soortgelijke vector met een stroomopwaartse T7-promoter) 13. Zuiveren het plasmide (pBSK-pPsaD) met behulp van een DNA-isolatie kit en controleer de sequentie door DNA-sequencing. LET OP: Al deze stappen maken gebruik van standaard moleculaire kloontechnieken. Bepaal de pBSK-pPsaD plasmide-DNA-concentratie onder toepassing van een spectrofotometer ingesteld op absorptie gemeten bij 260 nm. Verdun het plasmide tot een eindconcentratie van 10 ng / ul. Voer een 20 ul PCR (35 cycli) met de verdunde plasmide als matrijs. Bereid de reactie als volgt: 2 gl 10 x polymerase buffer, 2 pl 2 mM dNTP, 1 ul 5 mM M13 voorwaartse primer (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 ui 5 mM M13 reverse primer (5 '-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 pl verdund pBSK-pPsaD plasmide, 1 U Taq polymerase en gedestilleerd water om het totale reactievolume aan te20 pi. Gebruik een standaard PCR-programma, als volgt: 95 ° C, 5 min; 35 cycli van [95 ° C, 30 sec; 56 ° C, 30 sec; 72 ° C, 30 sec); en 72 ° C, 5 min. Run 5 pi van het PCR product op een 1% (w / v) agarosegel in TAE buffer (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA) om correcte amplificatie van het cDNA controleren en kwantificeren van de relevante band opzichte van normen om de concentratie te bevestigen. Bewaar de rest van het product bij -20 ° C voor verdere toepassingen. Bereid een 50 pi reactie met een konijnen reticulocyten lysaat gebaseerde celvrije transcriptie / translatiesysteem compatibel met PCR DNA, als volgt: 40 pl reticulocytlysaat van het transcriptie / translatiesysteem, 2,5 gl radioactief gemerkt [35S] methionine, 11 uCi / ml (specifieke activiteit> 1000 Ci / mmol), 2,5 ui steriel gedistilleerd water en 5 ui pPsaD PCR product (100-800 ng). Let op: Draag handschoenen, laboratorium kleding en veiligheid glasses bij de omgang met radioactief materiaal. Bewaken en te ontsmetten het werkoppervlak en de uitrusting. Gooi alle radioactief afval in een erkende afvalcontainer. Incubeer het reactiemengsel gedurende 90 min in een 30 ° C waterbad. Stop de reactie door het plaatsen van het monster op het ijs. Verwijderen 1 pi van de reactie als een testmonster (hetzelfde volume kan ook dienen als input control voor stap 5,7) ter controle op standaard natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) gevolgd door autoradiografie, fluorografie en fosfor beeldvorming. Een goed resultaat wordt aangegeven door de waarneming van een duidelijke en sterke band die overeenkomt met het molecuulgewicht van pPsaD (~ 23 kD). Bewaar de rest van het reactiemengsel bij -80 ° C voor verdere toepassingen. 3. Chloroplast Isolation Bereid de volgende voorraad oplossingen: Bereid Chloroplast Isolation Buffer (CIB, 2x): 0,6 M sorbitol, 10 mM magnesiumchloride(MgCl2), 10 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), 10 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 20 mM natriumbicarbonaat (NaHCO3), 40 mM 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES) ; op pH 8,0 met KOH. Bereid 2 L van 2x CIB, maken aliquots en bewaar ze bij -20 ° C voor langdurige opslag, of bij 4 ° C voor de korte termijn opslag. Om 1x CIB te maken, verdunnen de 2x CIB 1: 1 met gedestilleerd water; Dit kan vers worden bereid op de dag van chloroplast isolatie experiment. Bereid HEPES-MgSO4 -sorbitol buffer (HMS, 1x): 50 mm HEPES, 3 mM magnesiumsulfaat (MgSO4), 0,3 M sorbitol; op pH 8,0 met natriumhydroxide (NaOH). Bereid 400 ml buffer, maken aliquots en bewaar ze bij -20 ° C voor langdurige opslag, of bij 4 ° C voor de korte termijn opslag. Voeren alle van de volgende procedures in de koude kamer of op ijs. Te koelen alle oplossingen, inrichtingen, uitrusting, en rotors voor de starting. Bereid een continue dichtheidsgradiënt door het mengen van 13 ml Percoll, 13 ml 2x CIB buffer en 5 mg glutathion in een 50 ml centrifugebuis en centrifugeren van het mengsel bij 43.000 xg gedurende 30 min (rem uit) bij 4 ° C. Na centrifugeren, omgaan met de buis met zorg om te voorkomen dat het verstoren van de gradiënt en houd het op het ijs voor later gebruik. Breng 100 ml 1x CIB per genotype / voorwaarde om een ​​1 liter beker. Verwijder de zaailingen van het vloeibare medium door het kantelen van ze in een zeef en zet ze in een ander-CIB met beker; Vervolgens, spoel het weefsel met CIB om het resterende vloeibaar medium alvorens te vervangen door 100 ml vers CIB verwijderen. Voor homogenisatie gebruikt in totaal 100 ml 1x CIB per monster in vijf achtereenvolgende ronden van homogenisering, elke ronde gebruik 20 ml vers CIB gehouden in een 50 ml bekerglas. Voor de eerste ronde van homogenisatie Breng het plantenweefsel in de 50 ml beker met de hand, waardoor devorige Holding buffer om uit te lekken door je vingers. Probeer om het grootste deel van het weefsel te gebruiken in de eerste ronde, maar zorg ervoor dat het wordt ondergedompeld met buffer; Als dit niet mogelijk is, dient de onbeschreven weefsel bij de tweede ronde. Plaats probe van het weefsel in het weefsel homogenisator gehomogeniseerd en met twee pulsen van 1-2 s elk. Filter de homogenaat door middel van twee lagen van filtratie doek in een 250 ml centrifugebuis door zachte knijpen. Bewaar het filtraat, en het weefsel transfer terug naar de 50 ml beker. Plaats een tweede 20 mL aliquot CIB in de 50 ml beker, toevoeging restmateriaal niet in de eerste ronde van homogenisatie en herhaal de homogenisering en filtratiestappen. Aldus Herhaal stap 3,5 en 3,6 totdat alle 100 ml CIB is uitgeput (dat wil zeggen 5 aliquots van 20 ml) en voeg de resulterende filtraten. Centrifugeer de samengevoegde homogenaat bij 1000 x g gedurende 5 min (rem) bij 4 ° C en gietde supernatant onmiddellijk na voltooiing van het centrifugeren, verzorgen de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in de resterende supernatant links in de buis door zachtjes schudden van de buis op ijs. Niet krachtig mengen door pipetteren of vortexen. Zacht overdracht het homogenaat op de bovenkant van de premade continue dichtheidsgradiënt, met behulp van een Pasteur pipet toe te passen via de wand van het ontvangende buis. Vermijd verstoren het verloop. Centrifugeer in een swinging-bucket rotor bij 7800 xg gedurende 10 min (rem uit) bij 4 ° C. OPMERKING: Twee groene banden kan worden gezien in het verloop na het centrifugeren: de onderste band bevat intact chloroplasten, en de bovenste band bevat gebroken chloroplasten. Gooi de bovenste band door pipetteren en breng de onderste band met een Pasteur pipet in een verse 50 ml centrifugebuis, behouden een inhoud tot 8 ml per gradiënt. Voeg ~ 25 ml 1x HMS buffer in de buis en draai de buis tweemaal to Was de Percoll van de chloroplasten. Plaats de buis opnieuw in de swinging-bucket rotor en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten (rem) bij 4 ° C. Giet het supernatant voorzichtig resuspendeer de pellet in de chloroplast residuele HMS links in de buis door zachtjes schudden van de buis op ijs. Voeg een extra 100-300 pl HMS eventueel (gebaseerd op de grootte van de pellet en de telling in hoofdstuk 4), maar niet proberen het monster te veel verdund. Houd de chloroplasten op het ijs. Elke keer voordat de chloroplasten worden gebruikt voor downstream-toepassingen, schud de buis om ze te mengen. Gebruik altijd een cut pipet tip (met een vergrote poriën) aan de chloroplasten te dragen. 4. Analyse van de opbrengst en op beschadigingen van chloroplasten Voeg 5 ul van geïsoleerde chloroplasten tot 495 ul van 1x HMS buffer in een 1,5 ml buis, en dan meng voorzichtig door het omkeren van de buis om een ​​1 te verkrijgen: 100 verdunning. Place een cover glas op de top van de telkamer van de hemocytometer. Langzaam pipet ~ 40 – 60 pi van de verdunde suspensie chloroplast in de spleet tussen het dekglaasje en telkamer. Met behulp van een fase-contrast microscoop met een 10X of 20X objectief, intacte chloroplasten kijk rond en helder en worden omgeven door een aureool van licht. OPMERKING: Onder de microscoop is een 1 mm 2 tellen met 25 grote vierkanten, elk met 16 kleine vierkantjes in het midden van de telkamer. Tel het aantal chloroplasten in 10 grote pleinen. Het aantal chloroplasten per vierkante moet gemiddeld tussen de 10 en 30. Als er te weinig of te veel chloroplasten aanwezig zijn, stel de verdunningsfactor (stap 4.1 hierboven) dienovereenkomstig, en herhaal de procedure. Bereken het aantal chloroplasten per ml (concentratie) als volgt: n (het gemiddelde aantal chloroplasten per grote vierkante berekend in stap 4.3) × 25 (totaal aantal grote pleinen) X 100 (de verdunningsfactor) × 10 4 (schaalfactor gegevens per 1 ml tot expressie, aangezien het volume boven de 25 vierkanten is 0,1 mm 3). Berekent de werkelijke opbrengst van chloroplasten door de concentratie te vermenigvuldigen met het volume van chloroplast suspensie verkregen in stap 3.12. Gewoonlijk kan meer dan 50 x 10 6 chloroplasten worden verkregen. 5. Chloroplast Protein Import Bereid de volgende voorraad oplossingen: Bereid 10x HMS buffer: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO4, en 3,0 M sorbitol; op pH 8,0 met NaOH. Bereid 50 ml van deze buffer, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C voor langdurige opslag en bij 4 ° C voor korte-termijn opslag. Bereid Import stop buffer: 50 mM EDTA opgelost in 1x HMS buffer. Bereid 50 ml van deze buffer, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C. Bereid 2x eiwit laadbuffer: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) glycerol, 2% (w/ V) SDS, 0,005% (w / v) broomfenolblauw. Maak 50 ml, en bewaar bij 4 ° C. Net voor gebruik, voeg 100 ul van 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) tot 900 ul van buffer. Om een ​​tijdsverloop uitgevoerd met 3 tijdstippen, voor te bereiden 3 tubes met elk een 130 ul monster van import stop buffer, en laat ze op ijs. Bereid een 450 ul import reactie in een 2 ml buis (per genotype / conditie). Ontdooien alle ingrediënten vlak voor gebruik. Voor een import reactie gebruiken meestal 10 × 10 6 chloroplasten in A pi volume; bijvoorbeeld als de chloroplast concentratie 2,5 x 10 8 / ml, 40 ul gebruikt chloroplast suspensie. Drie tijdstippen zal 3 × A pi nodig (dat wil zeggen, 120 pl in ons voorbeeld). Meng de reacties componenten op het ijs in de volgende volgorde: gedestilleerd water (om het totale volume 600 pi te maken), B ul 10x HMS buffer (waarbij B = [600-3 × A] / 10, dwz 48 in ons voorbeeld), 12 pi1 M gluconzuur (kaliumzout), 6 pl 1 M NaHCO3, 6 pl 20% (w / v) BSA, 30 pl 100 mM adenosine 5'-trifosfaat magnesiumzout (MgATP), 24 ul 250 mM methionine (niet radioactief gelabeld ) en 30 pi voorlopereiwit. Onmiddellijk vóór het begin van de import reactie, voeg 3 × A pi van chloroplasten en meng door voorzichtig de buis te tikken. Incubeer de reactiebuis bij 25 ° C in een waterbad onder 100 umol m · – · 2 s – 1 licht. Af en toe flick de buizen chloroplasten mengen. Om een ​​tijdsverloop te voeren, in te trekken 130 pi monsters uit de reactie op de vereiste tijdstippen binnen het lineaire gebied van import, die voor pPsaD is tot ~ 12 min (4, 8 en 12-min tijdstippen zijn geschikt in dit geval). Het lineaire bereik termijn kan variëren voor verschillende eiwitten 14. Derhalve wordt voorgesteld om voor elk individueel preproteïne testen t optimaliserenHij tijdstippen. Onmiddellijk na de intrekking, overdragen elk 130 pi hoeveelheid om een ​​buis van ijskoude import stop buffer, meng door voorzichtig de buis te tikken, en behouden alle buizen op ijs tot het tijdsverloop is afgerond. Centrifugeer alle monsters gedurende 30 seconden bij 12.000 x g in een microfuge, gooi de supernatanten door pipetteren en resuspendeer pellets in 15 ul 2x eiwit laadbuffer door vortexen. Analyseer de monsters plus de pPsaD invoerbesturingselement (met pPsaD gelijk aan 10% van de toegevoegde elke invoer reactie bedrag uit stap 2,7) door middel van standaard SDS-PAGE en autoradiografie, fluorografie of fosfor beeldvorming 15. Gebruik beeldanalyse software te kwantificeren en analyseren van de resultaten. Om een ​​indicatie van de import efficiëntie, de hoeveelheid geïmporteerde eiwit in verschillende genotypen / voorwaarden kan worden beoordeeld door het meten van de radioactiviteit in verband met elke volwassen band.