обнаружение<em> Trypanosoma brucei</em> Вариант поверхности гликопротеин Переключение с помощью магнитных Активированный сортировки клеток и проточной цитометрии

Простейшим паразитом, Trypanosoma brucei, является возбудителем заболеваний , которые влияют на людей (через Trypanosoma brucei gambiense и Trypanosoma brucei rhodesiense) и животных (через Trypanosoma brucei brucei) во всей Африке к югу от Сахары. Он передается хозяину млекопитающего через слюну цеце вектора мухи. Оба человека и животных Африканский трипаносомоз вызывают серьезное экономическое бремя в эндемичных районах, а также несколько препаратов доступны или в развитии для лечения этих болезней. Понимание механизмов иммунной уклонения имеет решающее значение для разработки лекарств для трипаносомозу. Антигенная изменчивость плотного вариантные покрытия поверхности гликопротеина (VSG) , который покрывает паразита является одним из основных средств , с помощью которых Т. brucei уклоняется реакции антитела млекопитающих. Около 2000 вариантов гена VSG существуют в геноме трипаносом, но только один транскрибируется в любой момент времени от одного из ~ 15 Expresсайты Sion. "Переключение" выраженного VSG может происходить либо путем копирования гена VSG в сайт активного выражения, или путем транскрипционной активации ранее немого сайта выражения (обзор ^1).

Хотя большая работа посвящена исследованию антигенной изменчивости T. brucei, факторы, влияющие на частоту переключения до сих пор плохо изучены. Исследования на сегодняшний день было затруднено тем , что в то время как переключение происходит стохастически в пробирке, частоты переключения очень низкие, порядка 1 в приблизительно 10 ⁶ клеток ^2. Это делает его трудно измерить ли уменьшение заданного возрастает фактор или частоту переключения, так как переключение трудно обнаружить в первую очередь. До 2009 года, методы выделения коммутаторами в данной популяции были длительными и трудоемкими. К ним относятся пассажей трипаносом через мышей, иммунизированных против доминирующего VSG, а затем сбора клетокчерез день ^3, или считая сотни клеток с помощью иммунофлуоресценции ^4,5. Другая стратегия зависит от отбора на устойчивость к лекарственным препаратам для выделения коммутаторами ^6. Поскольку африканские трипаносомы , выращенные в пробирке , как правило , состоят из большого населения , выражающего один крупный вариант, и гораздо меньшее население коммутаторами , выражающих альтернативные варианты, мы имеем в виду основной вариант в этой статье в качестве доминирующей, начиная VSG. При этом мы ни в коей мере хотим сказать, что этот крупный вариант имеет большую пригодность по сравнению с другими вариантами в популяции.

Здесь мы опишем метод, который может надежно оценить число трипаносом, выражающую недоминирующую VSG в данной популяции в 3 – 4 ч. Этот метод особенно полезен, когда кто-то хочет, чтобы установить, увеличивает ли данное генетическое манипулирование или медикаментозное лечение количество коммутируемых клеток в популяции. Вместо того, чтобы избавить население клеток, экспрессирующих Д.О.СМОРОДИНСКИЙ, начиная VSG через наркотики или иммунологическими средствами, эти клетки уничтожаются путем первого нанесения на них магнитными гранулами, соединенными с антителом против доминирующего VSG, а затем изолировать их на магнитной колонке. Коммутируемая население затем собирают в проточные и вновь окрашивали Флуорофор меченными анти-VSG антитела для выявления загрязняющих веществ. Количественное достигается путем добавления определенного числа абсолютных счетных бус для каждого образца так , что отношение бусинок к клеткам могут быть определены и использованы для количественного определения количества коммутаторами в популяции ^7.