の検出<em>トリパノソーマ</em磁気活性化細胞選別し、フローサイトメトリーによって>バリアント表面糖タンパク質の切り替え
Summary
African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.
Abstract
Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.
Introduction
寄生原虫、 トリパノソーマは 、サハラ以南のアフリカ全域（ トリパノソーマブルセイを介して）や動物（ トリパノソーマガンビアとトリパノソーマローデシア経由）人間に影響を与える疾患の原因物質です。なお、ツェツェバエベクターの唾液を介して哺乳動物宿主に伝達されます。人間と動物、アフリカトリパノソーマ症の両方が流行地域に深刻な経済的負担を引き起こす、といくつかの薬が利用可能であるか、またはいずれかの疾患を治療するために開発中です。免疫回避のメカニズムを理解することは、トリパノソーマ症用薬の開発のために重要です。寄生虫をカバーして密な、バリアント表面糖タンパク質（VSG）コートの抗原性の変化は、主要な手段の一つであることでT.トリパノソーマは、哺乳類の抗体応答を逃れます。 VSG遺伝子の約2,000の変異体は、トリパノソーマのゲノムに存在するが、一つだけは〜15 EXPRESの1から任意の時点で転写されますシオンサイト。表現VSGの「切り替えは、「アクティブ発現部位にVSG遺伝子をコピーすることによって、または（1件）以前にサイレント発現部位の転写活性化のいずれかによって発生する可能性があります。
多くの仕事は、Tにおける抗原変異を理解することに専念してきたがトリパノソーマは 、スイッチング周波数の影響を与える要因は、まだよく理解されていません。これまでの研究では、約10 6セル2 1の順に、スイッチングがインビトロで確率的に発生している間、スイッチング周波数が非常に低いという事実によって妨げられてきました。これは、それが困難なスイッチングが最初の場所で検出が困難であるため、スイッチング周波数を減少させ、所定の係数が大きくなるかどうかを測定することができます。 2009年以前には、所定の集団でスイッチャーを単離するための方法は、長く、労働集約的でした。これらには、が支配的VSGに対して免疫化したマウスを通じてトリパノソーマを継代した後、細胞を回収日後3、または免疫蛍光4,5によって細胞の数百を数えます。別の戦略は、スイッチャー6を単離するために、薬剤耐性の選択に依存しています。 インビトロで増殖アフリカトリパノソーマは、典型的には、1つの主要な変異体、および代替変異体を発現スイッチャのはるかに小さい人口を表現する大集団で構成されているので、我々は支配的な、出発VSGとしてこの論文を通じて、主要なバリアントを参照してください。そうすることで、私たちは決してこの主要な変異体は、集団内の他の変異体よりも大きな適応度を持っていることを暗示したいです。
4時間 – ここでは、確実に3に与えられた集団における非支配的なVSGを発現しているトリパノソーマの数を測定することができる方法について説明します。この方法は、1つの与えられた遺伝子操作または薬物治療が集団に切り替え細胞の数を増加させるかどうかを確認したい場合に特に有用です。代わりにDOを発現する細胞の集団をなくししますminantは、薬を介して、または免疫学的手段によってVSGを開始し、これらの細胞を最初に支配VSGに対する抗体に結合された磁気ビーズでそれらをコーティングした後、磁気カラム上でそれらを分離することによって除去されます。切り替え集団は、フロースルーに回収し、汚染物質を識別するためのフルオロフォア標識した抗VSG抗体で再度染色します。定量化は、細胞に対するビーズの比を決定し、集団7にスイッチャの数を定量するために使用することができるように、各サンプルの絶対計数ビーズの定義された数を加算することによって達成されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
実験技術に関しては、プロトコルの最も重要なコンポーネントは、冷たいすべてのサンプルを保っています。トリパノソーマは非常に迅速に、それらの表面9に結合した抗体の内在化が、このプロセスは、運動性に依存し、細胞を4℃に維持される限り、アッセイに影響を及ぼしません。全てのサンプルは、常に氷上で保存されるべきで、ピペッティングを25℃の実験室環境への暴露を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、トリパノソーマ、生物学上の一般的なアドバイスのためのジョージ・クロスを承認したいと思います。この作品はまた、DS、MRMへのNSF大学院研究フェローシップ（DGE-1325261）及びFNPにNIH / NIAID（助成金＃のAI085973）にビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団GCEの助成金によってサポートされていました。我々は、I-SCEI遺伝子と認識部位を含む菌株の使用をガラドリエルあばら家-マイナーに感謝します。
Materials
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
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