Nachweis von<em> Trypanosoma brucei</em> Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Der einzelliger Parasit, Trypanosoma brucei, ist ein Erreger von Krankheiten , die Menschen (über Trypanosoma brucei gambiense und Trypanosoma brucei rhodesiense) und Tiere (über Trypanosoma brucei brucei) in ganz Afrika südlich der Sahara beeinflussen. Es ist dem Säugetierwirt durch den Speichel der Tsetse-Fliege Vektor übertragen. Mensch und Tier afrikanischen Trypanosomiasis eine schwere wirtschaftliche Belastung in Endemiegebieten verursachen, und nur wenige Medikamente zur Verfügung stehen oder in der Entwicklung entweder Krankheit zu behandeln. Mechanismen der Immunumgehung zu verstehen, ist für die Entwicklung von Medikamenten für Trypanosomiasis kritisch. Antigenic Variation der dichten, Variant Oberflächen Glycoprotein (VSG) Mantel, der den Parasiten abdeckt , ist eine der wichtigsten Mittel , durch die T. brucei ausweicht die Säugetier-Antikörper – Reaktion. Ca. 2.000 Varianten des Gens VSG bestehen in Trypanosomen Genom, aber nur einer wird zu einem gegebenen Zeitpunkt transkribiert von einer ~ 15 Expression Websites. 'Switching' des exprimierten VSG kann entweder durch Kopieren eines VSG – Gens in den aktiven Expressionsstelle oder durch die Transkriptionsaktivierung eines zuvor stillen Expressionsstelle ( beschrieben in ¹⁾ auftreten.

Obwohl viel Arbeit zum Verständnis der Antigenvariation in T. gewidmet brucei, die Faktoren, die Frequenzeinfluss Schalt sind noch kaum verstanden. Bisherige Untersuchungen wurden durch die Tatsache erschwert , dass , während Schalt stochastisch in vitro auftritt, Schaltfrequenzen sehr niedrig sind, in der Größenordnung von 1 in etwa 10 ⁶ Zellen ^2. Dies macht es schwierig zu messen, ob ein gegebener Faktor erhöht oder Schaltfrequenz abnimmt, da Schalt hart ist in erster Linie zu detektieren. Vor 2009 Methoden für Switcher in einer bestimmten Population zu isolieren waren langwierig und arbeitsintensiv. Dazu gehörten Passagierung Trypanosomen durch immunisierten Mäuse gegen die herrschende VSG und dann erntet Zelleneinen Tag später ³ oder Hunderte von Zellen durch Immunofluoreszenz ^4,5 zu zählen. Eine andere Strategie stützt sich auf Auswahl für Medikamentenresistenz zu Switcher ⁶ isolieren. Da African in vitro gezüchtet Trypanosomen typischerweise aus einer großen Population gemacht werden eine wichtige Variante ausdrückt, und eine viel kleinere Population von Switcher ausdrücken alternative Varianten, verweisen wir auf die Hauptvariante in diesem Papier als dominant, beginnend VSG. Dabei wir in keiner Weise andeuten wollen, dass diese wichtige Variante mehr Fitness als andere Varianten in der Bevölkerung hat.

Hier beschreiben wir eine Methode, die die Anzahl der Trypanosomen Expression eines nicht-dominanten VSG in einer bestimmten Population in 3 zuverlässig messen kann – 4 Std. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, wenn man will, ob eine bestimmte genetische Manipulation oder medikamentöse Behandlung zu ermitteln, die Anzahl von geschalteten Zellen in einer Population erhöht. Anstatt die Population von Zellen zu befreien, die do ausdrückenminante, beginnend VSG durch Drogen oder durch immunologische Mittel werden diese Zellen durch diese zuerst mit magnetischen Kügelchen Beschichtung eliminiert gekoppelt Antikörper gegen das dominante VSG und dann auf einem Magnet Säule isoliert. Die geschaltete Population wird dann in der Durchströmungs gesammelt und wieder gefärbt mit einem Fluorophor anti-VSG markierten Antikörper Kontaminanten zu identifizieren. Die Quantifizierung erfolgt durch Zugabe einer definierten Anzahl von absolute Zählung beads zu jeder Probe erreicht , so daß das Verhältnis der Kügelchen zu den Zellen bestimmt und verwendet werden können , um die Anzahl von Umschaltern in der Population ⁷ zu quantifizieren.