détection de la<em> Trypanosoma brucei</em> Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

Le parasite protozoaire, Trypanosoma brucei, est un agent causal de maladies qui affectent les humains (via Trypanosoma brucei gambiense et Trypanosoma brucei rhodesiense) et les animaux (via Trypanosoma brucei brucei) dans toute l' Afrique sub-saharienne. Elle est transmise à l'hôte de mammifère par la salive du vecteur de la mouche tsé-tsé. Les deux humains et de la trypanosomiase animale africaine causent un fardeau économique sévère dans les régions endémiques, et peu de médicaments sont disponibles ou en développement pour traiter soit la maladie. mécanismes d'évasion immunitaire Comprendre est critique pour le développement de médicaments pour la trypanosomiase. La variation antigénique du dense, la variante glycoprotéine de surface (VSG) manteau qui couvre le parasite est l' un des principaux moyens par lesquels T. brucei soustrait la réponse d'anticorps de mammifère. Environ 2,000 variants du gène de VSG existent dans le génome du trypanosome, mais un seul est transcrit à un moment donné de l' une des ~ 15 expressites sion. «Switching» de la VSG exprimée peut se produire soit par copie d' un gène de VSG dans le site actif d'expression, soit par activation de la transcription d'un site d'expression précédemment silencieux (passé en revue dans ^1).

Bien que beaucoup de travail a été consacrée à la compréhension de la variation antigénique de T. brucei, les facteurs qui influent sur la fréquence de commutation sont encore mal compris. Les études menées à ce jour ont été entravés par le fait que , bien que la commutation se produit stochastiquement in vitro, des fréquences de commutation sont très faibles, de l'ordre de 1 à environ 10 ⁶ cellules ^2. Cela rend difficile de mesurer si une augmentation de facteurs donnés ou diminue la fréquence de commutation, étant donné que la commutation est difficile à détecter en premier lieu. Avant 2009, les méthodes d'isolement switchers dans une population donnée étaient longues et de main-d'œuvre. Ces cellules repiquage trypanosomes par des souris immunisées contre la VSG dominante et récolte inclusun jour plus tard ^3, ou de compter des centaines de cellules par immunofluorescence ^4,5. Une autre stratégie repose sur la sélection pour la résistance aux médicaments pour isoler switchers ^6. Parce que les trypanosomes africains cultivées in vitro sont généralement constitués d'une grande population exprimant une variante importante, et une population beaucoup plus petite de switchers exprimant des variantes alternatives, nous nous référons à la principale variante dans le présent document comme, VSG à partir dominante. Ce faisant, nous voulons en aucun cas impliquer que cette variante majeure a une plus grande remise en forme que d'autres variantes dans la population.

Nous décrivons ici une méthode qui peut mesurer de manière fiable le nombre de trypanosomes exprimant une VSG non dominante dans une population donnée dans 3 – 4 h. Cette méthode est particulièrement utile lorsque l'on veut déterminer si une manipulation génétique donnée ou un traitement médicamenteux augmente le nombre de cellules commutées dans une population. Au lieu de se débarrasser de la population de cellules exprimant le dominant, à partir VSG par des médicaments ou par des moyens immunologiques, ces cellules sont éliminées en premier les enrobant avec des billes magnétiques couplées à un anticorps dirigé contre la VSG dominante, puis de les isoler dans une colonne magnétique. La population commuté est ensuite recueillie dans le flux continu et coloré à nouveau avec un anticorps marqué anti-VSG fluorophore pour identifier les contaminants. La quantification est obtenue en ajoutant un nombre défini de billes de comptage absolu de chaque échantillon de telle sorte que le rapport des billes aux cellules peut être déterminée et utilisée pour quantifier le nombre de commutateurs dans la population ^7.