detectie van<em> Trypanosoma brucei</em> Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie

De protozoa parasiet, Trypanosoma brucei, is een verwekker van ziekten die de mens beïnvloeden (via Trypanosoma brucei gambiense en Trypanosoma brucei rhodesiense) en dieren (via Trypanosoma brucei brucei) gehele Sub-Sahara Afrika. Het is aan de zoogdiergastheer overgedragen via het speeksel van de tseetseevlieg vector. Zowel mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis leiden tot een ernstige economische last in endemische gebieden, en weinig drugs zijn beschikbaar of in ontwikkeling voor de behandeling van beide ziekten. Inzicht in de mechanismen van immune fraude is cruciaal voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor trypanosomiasis. Antigene variatie van het dichte, variant oppervlakte glycoproteïne (VSG) jas die de parasiet bedekt, is een van de belangrijkste manieren waarop T. brucei ontwijkt de zoogdier antilichaam respons. Ongeveer 2000 varianten van de VSG-gen aanwezig in het genoom trypanosoom, maar slechts één wordt getranscribeerd op een bepaald moment uit een van ~ 15 expresSion sites. Switching van de VSG expressie kan plaatsvinden hetzij door het kopiëren van een VSG gen in de actieve expressie plaatsen of door transcriptionele activering van een eerder stille expressieplaats (besproken in ^1).

Hoewel veel werk is besteed aan het begrip van antigene variatie in T. brucei, de factoren die van invloed schakelfrequentie zijn nog steeds slecht begrepen. Studies tot op heden belemmerd door het feit dat hoewel omschakelen gebeurt stochastisch in vitro schakelfrequenties zeer laag, in de orde van 1 op ongeveer 10 ⁶ cellen ^2. Dit maakt het moeilijk te meten of een bepaalde factor verhoogt of verlaagt schakelfrequentie, omdat schakelen moeilijk te detecteren in de eerste plaats. Voorafgaand aan 2009, werkwijzen voor het isoleren overstappers in een bepaalde populatie waren langdurig en arbeidsintensief. Deze omvatten passeren van trypanosomen door de muizen ingeënt tegen de dominante VSG en dan oogsten van celleneen dag later ^3, en tellen honderden cellen door immunofluorescentie ^4,5. Een andere strategie is gebaseerd op selectie voor drug resistentie tegen switchers ⁶ isoleren. Omdat Afrikaanse trypanosomen gekweekt in vitro gewoonlijk bestaan uit een grote populatie expressie één belangrijke variant, en een veel kleinere populatie overstappers expressie alternatieve varianten wordt verwezen naar de belangrijkste variant in dit document als dominante vanaf VSG. Daarbij we geenszins willen impliceren dat deze belangrijke variant een grotere geschiktheid dan andere varianten in de populatie.

Hier beschrijven we een werkwijze die betrouwbaar het aantal trypanosomen expressie een niet-dominante VSG in een bepaalde populatie te meten 3 – 4 uur. Deze werkwijze is bijzonder bruikbaar wanneer men wil nagaan of een bepaalde genetische manipulatie of medicatie verhoogt het aantal geschakelde cellen in een populatie. In plaats van bevrijden de populatie van cellen die de dominant Neem VSG door middel van drugs of immunologische middelen, worden deze cellen geëlimineerd door eerst te coaten met magnetische korrels gekoppelde antilichaam tegen de dominante VSG en isoleren ze op een magnetische kolom. De geschakelde populatie wordt vervolgens verzameld in de doorstroom en opnieuw gekleurd met een fluorofoor gemerkt anti-antilichaam VSG verontreinigingen identificeren. Kwantificering wordt bereikt door een bepaald aantal absolute tellen van kralen toevoegen aan elk monster zodat de verhouding van kralen cellen kan worden bepaald en gebruikt om het aantal overstappers kwantificeren de bevolking ^7.